1型人类免疫缺陷病毒体外复制、检测系统的建立及评价

李杰，陈佩玉，郑毅，吴南屏

1型人类免疫缺陷病毒体外复制、检测系统的建立及评价

李杰，陈佩玉，郑毅，吴南屏

目的建立1型人类免疫缺陷病毒（HIV-1）体外复制和检测系统（JLTRG/H9细胞混合培养体系），并初步应用于抗HIV-1有效药物筛选。方法JLTRG细胞与H9细胞按不同比例混合培养后，通过流式细胞技术分别于24、48、72、96h观察和检测JLTRG细胞增强绿色荧光蛋白（EGFP）的表达来评估JLTRG细胞感染程度，并以此确定最优感染体系。然后以此最优体系来筛选抗HIV-1有效药物。结果（1）在JLTRG/H9细胞混合培养体系中，JLTRG与H9细胞混合培养比例为10︰1时，JLTRG细胞EGFP表达量在各个时间点均为最高。（2）在JLTRG/ H9细胞混合培养体系（JLTRG与H9细胞数比值10︰1）中，T-20能有效抑制JLTRG细胞EGFP的表达，并且呈现剂量依赖性。结论JLTRG/H9细胞混合培养体系（JLTRG与H9细胞数比值10︰1）适用于HIV-1药物筛选。【关键词】获得性免疫缺陷综合征；HIV-1；JLTRG细胞；H9细胞；药物筛选检测

在艾滋病治疗方面尚无根治性的治疗方法。虽然高效抗逆转录病毒疗法（HAART）可减少艾滋病患者的机会性感染、延长生存期[1]；但病毒存在变异且可在细胞内潜伏感染，使其不能完全清除感染者体内的潜伏1型人类免疫缺陷病毒（HIV-1）病毒[2]。HIV-1基因易变异及其免疫逃逸的特点致使耐药毒株的不断增多，此外当前主流HIV-1药物副作用亦较多，给治疗带来了严重的挑战，新的抗HIV-1药物开发迫在眉睫。笔者建立以JLTRG细胞基础HIV-1体外复制、检测系统，报道如下。

1 材料与方法

1.1 试验材料、仪器JLTRG细胞、H9细胞株购自ATCC（HTB-176）。流式细胞仪：BeckmanCoulterPC500MPL，美国。

1.2 实验方法

1.2.1 HIV-1体外复制、检测系统的建立JLTRG细胞和H9细胞混合培养，见表1，分别于24、48、72、96h吹打混匀细胞，取180l细胞混合液于流式细胞仪专用试管，加20 l40%甲醛混匀至终浓度4%，室温静置20min后，立即上机用流式细胞仪检测。

1.2.2 HIV-1体外复制、检测系统的评价（1）JLTRG、H9细胞的T-20药物毒性试验。取收集好的细胞以PBS缓冲液洗涤2次，1 000 r/min，5 min离心，弃上清，以无血清培养基重悬，轻轻吹打成单细胞悬液，调整细胞密度为1.0×104/ml JLTRG或H9细胞接种于96孔培养板中，设置10组，分别为空白对照组、T-20浓度分别为7.8 nmol/L组、1.56 nmol/L组、3.12 nmol/L组、6.25 nmol/L组、1.25 nmol/L组、2.5 nmol/L组、5.00 nmol/L组、1.00 nmol/L组和2.00 nmol/L组，每组设置3个复孔，每孔调整细胞体积为180 l，置于37℃、体积分数5%CO2饱和湿度培养箱中培养4 h，取出培养板，每孔细胞中加入20l胎牛血清放回CO2培养箱中继续培养。作用96 h后，分别每孔加入MTT工作液20 l，放回CO2培养箱中作用4h，取出96孔板，以3000r/min，15 min离心，小心弃去上清，每孔加入DMSO 200 l，震荡，使底部蓝紫色甲臜沉淀充分溶解。在酶标仪570 nm波长处读取吸光度值（A）。以空白对照组为100%。实验重复3次。（2）JLTRG细胞和H9细胞混合培养（JLTRG与H9细胞浓度比10︰1），设立T-20不同浓度梯度药物组和对照组，见表2，分别于24、48、72、96 h流式细胞术检测。

2 结果

2.1 HIV-1体外复制、检测系统的流式细胞检测结果（1）JLTRG细胞+H9细胞上清孔：96 h内JLTRG细胞EGFP表达量无明显改变。（2）JLTRG细胞孔（阴性对照孔）：JLTRG细胞的EGFP表达量低，并且96 h内无明显改变。（3）JLTRG：H9细胞比例为10︰1时，24、48、72、96h的值6.05、30.52、90.72、204.10，高于JLTRG/H9为640︰1的值。（4）按细胞混合比例来观察：JLTRG︰H9细胞比例为10︰1至640︰1，荧光显微镜下观察EGFP表达逐渐下降。（5）按细胞混合培养时间来观察：JLTRG、H9细胞混合培养，随时间的延长，JLTRG细胞EGFP表达量增加。96 h时间点各个浓度比例细胞混合体系EGFP表达量最高。见封二彩图6。

表1 JLTRG/H9细胞混合培养体系优化试验

2.2 HIV-1体外复制、检测系统评价

2.2.1 细胞毒性试验不同浓度T20作用于JLTRG、H9细胞测MTT的A相当，见封三彩图1、2。

2.2.2 流式细胞检测结果（1）第10孔中JLTRG细胞EGFP表达量于96 h内改变不明显。（2）阴性对照孔的EGFP表达量于96 h内无明显改变；阳性对照孔（JLTRG细胞数：H9细胞数为10︰1）的EGFP表达量与96 h内逐渐增加，呈时间依赖性。（3）在该JLTRG/H9细胞混合培养体系中，T-20浓度≥0.064nmol/L时，与阳性对照孔相比，其余各孔JLTRG细胞EGFP表达量增幅相对较小，并且呈现T-20浓度依赖效应，即T-20浓度愈高，体系中JLTRG细胞的EGFP表达量增加量相对愈少。（4）在单一T-20浓度上，随着时间延长，其内JLTRG细胞表达的EGFP量增多，但与阳性对照孔相比，EGFP表达量增幅较小。（5）IC50波动于1.6～40 nmol/L。但T-20抗HIV-1作用与IC50区段仍然可重复。见封三彩图3。

3 讨论

抗HIV药物大致分为逆转录酶抑制剂[3]、HIV蛋白酶抑制剂[4]、HIV整合酶抑制剂[5]及抑制HIV病毒的进入抑制剂[6]等，传统的抗药物以病毒复制过程中的蛋白酶和逆转录酶为靶点，仍存在耐药性问题、药物毒性强、不能根除HIV病毒等问题[7]。本研究发现24、48、72、96 h，JLTRG+H9上清组与对照组无明显差别，提示HIV-1感染的JLTRG细胞并不多，H9上清感染JLTRG细胞的模式并不适合应用于抗HIV-1药物筛选模型。因此应用混合培养体系以建立HIV-1体外复制检测体系，结果显示：（1）该体系荧光背景低，适于结果分析。（2）JLTRG：H9细胞比例为10︰1混合培养时，体系中JLTRG细胞感染效率最高，提示JLTRG/H9细胞混合培养体系最优比值10︰1。（3）按细胞混合培养时间显示：随时间的延长，JLTRG细胞EGFP表达量增加，呈现时间依赖性。因此，JLTRG/ H9细胞混合培养体系中JLTRG细胞与H9细胞数比例定为10︰1。

表2 HIV-1体外复制系统和检测系统评价-T-20

T-20是一种HIV-1融合抑制剂，可降低感染者的病毒HIV-1 RNA水平并增加CD4+细胞数量，也可联合其他药物用于HIV-1感染治疗[8]。它结合于HIV-1 gq41蛋白从阻止HIV-1病毒侵入宿主细胞及感染细胞间的融合而发挥效用[9]。JLTRG、H9细胞细胞毒性试验结果显示无细胞毒性，故T-20可用于抗HIV-1药物验证试验。本研究显示：（1）在该JLTRG/H9细胞混合培养体系中，T-20浓度≥0.064 nmol/L时，与阳性对照孔相比，其余各孔JLTRG细胞EGFP表达量增幅相对较小，并且呈现T-20浓度依赖效应，即T-20浓度愈高，体系中JLTRG细胞的EGFP表达量增加量相对愈少。这说明T-20在该体系中发挥了良好的抗HIV-1的药效。（2）在固定T-20浓度（T-20浓度≥0.064 nmol/L），随着时间延长，其内受HIV-1感染的JLTRG细胞比例增加，但与阳性对照孔相比，EGFP表达量增幅较小。这可能与H9不断增值以及其持续释放大量的HIV-1病毒颗粒、T-20耗竭有关。（3）T-20 IC50波动于1.6～40 nmol/L，但T-20抗HIV-1作用与IC50区段仍然可重复。IC50波动可能与JLTRG、H9细胞状态关系有关，但基本趋势与IC50区段仍然可重复。因此，JLTRG/H9细胞混合体系具有可重复性、较稳定、可靠，并且具有以上优点。

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10.3969/j.issn.1671-0800.2016.12.052

R446

A

1671-0800(2016)12-1640-03

2016-09-15

（本文编辑：孙海儿）

国家科技重大专项课题任务资助项目（2008ZX10001-006）

325001浙江省温州，温州医科大学附属第二医院（李杰、郑毅）；台州医院（陈佩玉）；浙江大学医学院附属第一医院（吴南屏）

吴南屏，Email:zhyygrxzz @163.com