骨架蛋白ENH在心血管系统中作用的研究进展

朱政怡 戚彤云 张 雪 柯越海 程洪强

骨架蛋白ENH在心血管系统中作用的研究进展

朱政怡 戚彤云 张 雪 柯越海 程洪强

ENH是一个含有PDZ和LIM结构域的骨架蛋白，存在多种mRNA剪接体，不同的剪接体具有不同的组织表达方式和功能。ENH在心血管系统中发挥骨架蛋白的结构功能，在心脏发育和维持心脏Z线结构稳定中有重要作用。ENH还能与不同的蛋白激酶结合，作为信号分子的锚定蛋白，调控信号转导，调节心肌细胞的生长、血管平滑肌细胞的增殖与迁移。

心血管系统；ENH；骨架蛋白；锚定蛋白

心肌细胞与骨骼肌细胞是具有收缩功能的高度分化的肌细胞。肌小节是肌细胞结构与功能的最小单元。连接两个相邻肌小节的重要结构是Z线，由辅肌动蛋白α-Actinin-2以及与之结合的蛋白组成的蛋白复合体或蛋白质机器构成，在电镜下为特征性的暗线。编码Z线蛋白的基因突变是肥厚型和扩张型心肌病的主要遗传因素。研究发现，Z线不仅维持肌小节结构稳定，还是肌细胞感受力和传递信号的关键节点[1]。骨架蛋白ENH(Enigma homolog)与辅肌动蛋白结合，在肌细胞中主要位于肌小节的Z线[2]，与其他Z线蛋白相互作用维持Z线的稳定，同时参与胞内信号的传递，是典型的Z线蛋白，在心血管系统中发挥重要作用。

1 ENH概述

ENH又名PDLIM5，属于PDLIM蛋白家族[3-5]。PDLIM蛋白家族以含有PDZ和LIM结构域为特征，在哺乳动物中有10个编码基因，根据蛋白结构特征可分成4个亚族。其中Enigma亚族包括Enigma、ENH和Cypher 3个基因，编码的蛋白含有N端的PDZ结构域和C端的3个LIM结构域[5]。PDZ和LIM结构域的主要功能是参与蛋白间相互作用。PDZ结构域由80～100个氨基酸残基组成，主要结合蛋白的疏水C末端。LIM是由大约55个氨基酸残基组成的小结构域，含有半胱氨酸丰富的保守序列CX2CX16-23HX2CX2CX2CX16-21CX2(Cys/His/Asp)，与锌离子(Zn2+)结合形成特殊双锌指结构，不与核酸分子结合，介导蛋白间相互作用[5]。ENH通过PDZ和LIM结构域与众多蛋白相互作用，形成蛋白复合体，分别发挥细胞骨架和信号转导作用。见表1。

表1 与ENH相互作用的蛋白列表

注：ENH 选择性与PKCβ1、γ和ε结合，不与PKCα、δ和ξ结合；N/A为相互作用的结构域未进一步分析

2 ENH mRNA剪接

在哺乳动物中，大于95%的mRNA存在选择性剪接，基因通过剪接可以产生多种蛋白[6]。ENH mRNA存在复杂的剪接，产生的蛋白可以分成两组，含有3个LIM结构域的长剪接体和不含LIM结构域的短剪接体，长短剪接体又各自包含4～5种剪接体[7-8]。小鼠的ENH基因包含20个外显子，外显子1～3编码N端PDZ结构域，外显子17～20编码C端的3个LIM结构域。外显子5存在长(5)和短(5’)两种形式，产生ENH1a(5)和ENH1b(5’)两种产物，还可以与外显子12～14组合产生3种不同剪接产物(ENH1c～ENH1e)。同样，外显子5和5’与外显子6～8组合可产生4种ENH短剪接产物(ENH2、ENH3a、ENH3b和ENH4)。

ENH mRNA剪接有组织特异性，长剪接体在多种组织中表达，包括心脏、大脑、脾脏、肝脏和肾脏，而短剪接体只在心肌和骨骼肌中高表达[4, 9]。ENH mRNA剪接还与发育过程有关，在心脏和骨骼肌中，长剪接体是胚胎型，在胚胎中表达高，出生后逐渐降低；短剪接体是成体型，在胚胎中表达低，出生后逐渐升高[8, 10]。在骨骼肌细胞C2C12体外分化过程中，不同的ENH剪接体具有类似的表达模式[8, 11]。这种与发育相关的剪接模式在Enigma亚族的Cypher mRNA上也存在[12]。此外，ENH mRNA剪接还与疾病相关，在心肌肥厚小鼠心脏中，ENH mRNA剪接转变成胚胎型，即长剪接体表达升高，短剪接体表达降低[10]。因此ENH剪接方式的变化可能参与心肌病的病理发生过程[13-14]。

3 ENH在心脏发育中的作用

心脏是胚胎早期发育并发挥功能的器官。ENH在小鼠胚胎发育早期的心脏区高表达[15]，可能是心脏发育早期重要转录因子Mesp1和Mef2A作用的结果[16-17]，表明ENH可能在心脏发育过程中发挥作用。然而ENH基因敲除小鼠胚胎没有明显的心脏发育缺陷，推测是由于ENH同亚族的Cypher或Enigma发挥了替代作用[7]。与ENH相似，Cypher在小鼠心脏发育早期高表达，Cypher敲除小鼠也没有明显的发育缺陷[18]。而ENH/Cypher双敲除小鼠在胚胎发育早期死亡，有明显的心脏发育缺陷，包括心管扩张、心包积液、心室壁变薄以及心脏发育迟缓[15]，提示Enigma亚族的ENH与Cypher在心脏发育中确实存在功能上的冗余。在一项对室间隔缺损胎儿全基因组DNA甲基化修饰的分析中发现，室间隔缺损的胎儿ENH启动子甲基化水平低，室间隔缺损与ENH的高表达有关[19]。

ENH的不同剪接体对心肌发育有不同的作用。体外研究发现ENH长剪接体(ENH1a)能增加肌细胞分化转录因子MyoD和Myogenin的表达，促进心肌细胞肥大，而短剪接体(ENH4)具有相反的作用，可抑制苯肾上腺素诱导的心肌细胞肥大[11]。

4 ENH在维持心血管系统结构中的作用

免疫荧光染色显示ENH主要分布在心肌细胞肌小节的Z线上，因此ENH可能与肌细胞的收缩相关。ENH敲除小鼠可出现扩张型心肌病，表现为左心室壁变薄、左心室腔增大、心脏收缩和射血功能减弱[7]。ENH敲除还会使小鼠心肌细胞的基因表达向胚胎型偏转(如心房利钠肽、B型利钠肽、β肌球蛋白重链、骨骼肌肌动蛋白等表达升高)。ENH的缺失导致与其相互作用的Z线蛋白Calsarcin-1和Cypher短剪接体Cypher2c显著减少。超显微结构分析显示ENH敲除小鼠肌小节Z线增宽，结构混乱。这些结果说明ENH参与维持心肌肌小节Z线结构的稳定。

在压力和损伤作用下，心脏会发生重构，表现为心肌纤维化和心肌细胞病理性生长，导致心力衰竭发生。心脏重构时，心脏成纤维细胞通过外泌体包裹的微小RNA-21(miR-21)作用于心肌细胞，降低miR-21靶标基因ENH的表达，诱导心肌病理性肥厚，提示ENH在维持心肌稳态中发挥重要作用[20]。人类ENH的编码基因是否存在与心肌病相关的突变及ENH在人类心血管结构中的作用尚不清楚。

5 ENH在心血管系统中的信号转导作用

ENH在心血管系统中还发挥信号转导作用。ENH是在寻找与蛋白激酶C(PKC)β1相互作用的新蛋白时被发现的，ENH的LIM结构域与PKCβ1的N端V1区结合，可被PKC磷酸化[4]。敲除ENH不影响心脏中PKC的表达[7]。在PKC的不同亚型中，ENH与PKCβ1、γ和ε结合，而不与PKCα、δ和ξ结合[4]。Enigma亚族的Cypher能与上述6种PKC亚型结合[21]，而Enigma只与PKCα、β1和ξ结合，说明Enigma亚族蛋白的LIM结构域都能与PKC结合，但通过结合不同的PKC亚型表现功能上的特异性。ENH可招募PKCβ1到细胞膜并增强其激酶活性，而不需要PKC的活化分子如二酰基甘油或者磷脂酰丝氨酸的参与[22]。Enigma亚族中Cypher和Enigma也具有相同的功能，但PDLIM蛋白家族中其他成员仅能与PKC结合，不具有活化PKC的功能。活化的PKC能够直接磷酸化环磷腺苷效应元件结合蛋白(CREB)，或者通过活化蛋白激酶D1(PKD1)，后者再磷酸化CREB[23]，磷酸化的CREB进入心肌细胞核发挥转录因子的功能，促进心肌细胞生长。这一过程是通过ENH的LIM结构域实现的，因此不含LIM结构域的ENH短剪接体不具有该功能，相反，ENH短剪接体可抑制PKC活化、CREB磷酸化以及心肌的病理性肥厚。

ENH还可与蛋白激酶A(PKA)和PKD相互作用[24-25]。ENH通过PDZ结构域结合心肌细胞L-型钙离子通道(L-type calcium channel, LTCC)，协助PKD1或PKA磷酸化LTCC胞内段(如1928位点的丝氨酸残基Ser1928)，调节细胞钙流，参与肾上腺素能受体介导的增强心肌收缩的信号转导。ENH在这方面的作用可能与Cypher存在重叠[24]。在对急性心肌梗死动物心脏的磷酸化蛋白质谱分析中发现，ENH和肌钙蛋白I(cTnI)磷酸化水平显著下降，其中，ENH的Ser118和cTnl的Ser22/23位点是PKA的作用位点[26]。ENH等肌纤维蛋白的磷酸化形式可能在维持心脏结构与信号转导方面都发挥了重要作用。

除了心肌，ENH还在血管平滑肌中发挥重要的作用。AMP活化蛋白激酶(AMPK)是细胞内的能量传感器，通过调控微管和微丝的动态组装过程调节细胞的极性形成和运动。在血管平滑肌细胞中，AMPK通过磷酸化ENH(Ser177)抑制Rac1的活性，下游分子Arp2/3蛋白随之离开细胞片状伪足前沿，破坏了应力纤维的组装，抑制了伪足形成和细胞迁移[27]。ENH在肺动脉高压患者和小鼠模型的肺动脉平滑肌中表达升高，降低ENH的表达会活化转化生长因子β(TGFβ)的信号通路，促进肺动脉高压的发生[28]。ENH可能成为肺动脉高压治疗的新靶点[29]。

6 结语

骨架蛋白ENH通过PDZ和LIM结构域与其它蛋白结合维持心肌细胞结构，尤其是心肌细胞在收缩过程中肌小节的结构。ENH还具有信号转导方面的功能，可与蛋白激酶(PKA、PKC、PKD1和AMPK)及其底物直接作用，发挥锚定蛋白的功能，参与心肌细胞和血管平滑肌细胞的生长、增殖、分化和迁移。深入研究ENH在心血管系统中的作用，有助于设计与开发以骨架蛋白为靶点的新型心血管药物。

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(收稿：2016-06-01 修回：2016-08-11)

(本文编辑：胡晓静)

国家自然科学基金(81170117，31471258)

310058 杭州，浙江大学基础医学院病理与病理生理学系

程洪强，Email：hqcheng11@zju.edu.cn

10.3969/j.issn.1673-6583.2016.06.009