WWOX蛋白与突变型P53蛋白在非小细胞肺癌中的表达及意义

王军

(滁州市第一人民医院，安徽 滁州 239000)



WWOX蛋白与突变型P53蛋白在非小细胞肺癌中的表达及意义

王军

(滁州市第一人民医院，安徽 滁州 239000)

目的 探讨WWOX与突变型P53蛋白在非小细胞肺癌(NSCLC)及癌旁组织中的表达与肿瘤临床病理参数的关系及两者表达的相关性。方法 用免疫组化elivision法分别检测WWOX及突变型P53蛋白在51例NSCLC及20例癌旁正常组织中表达情况。结果 WWOX蛋白在NSCLC组织中与癌旁正常组织中表达的阳性率分别为25.49%(13/51)和85.0%(17/20)。突变型P53蛋白在NSCLC组织中与癌旁正常组织中表达的阳性率分别为58.82%(30/51)和10.0%(2/20)。WWOX蛋白的阳性率与NSCLC的组织分化程度、病理类型、吸烟、有无淋巴结转移的表达差异有统计学意义(P<0.05)，而与患者的年龄、性别及肿瘤TNM分期无关(P>0.05)。突变型P53的阳性率与NSCLC的分化程度、肿瘤TNM分期、有无淋巴结转移有关(P<0.05)，而与患者的年龄、性别、吸烟、病理类型无关(P>0.05)。WWOX蛋白、突变型P53在NSCLC中的阳性表达呈负相关(r=-3.33，P<0.05)。 结论 WWOX蛋白和突变型P53在NSCLC及癌旁组织的表达有显著差异。WWOX与突变型P53蛋白与NSCLC的发生、发展密切相关，并可能起协同作用，其综合检测对肺癌的病情判断和预后评价具有一定价值。

非小细胞肺癌； WWOX； P53； 免疫组化

细胞的生长是推动细胞周期与抑制其进行的基因之间微妙平衡的结果。任何一种产物的表达异常，都可能导致细胞生长的失控。肿瘤抑制基因是在正常细胞中存在的一类基因，抑制细胞过度生长、增殖而抑制肿瘤的发生。包含氧化还原酶的WW域基因(WWOX)是2000年由A.K.Bednarek[1]等鉴定出一个候选的抑癌基因，位于在染色体普通脆性位点FRA16D(16q23-32q24.1)区域。本研究用免疫组化方法检测WWOX 蛋白、突变型P53在NSCLC组织中的表达，并分析其与临床病理参数的关系及两者的相关性，旨在初步明确二者在NSCLC发生、发展、转移中的作用，尤其是明确其与NSCLC淋巴结转移的关系，为患者的预后判断提供有价值的分子生物学指标。

1 材料与方法

1.1 标本及临床资料 选取蚌埠医学院第一附属医院2009年4月至2011年7月肺癌手术切除标本51例，经病理证实为NSCLC，并取癌旁正常组织20例，年龄41～76岁，中位年龄68.2岁。排除术前有放射治疗或化学治疗史的患者。51例肺癌患者中，男性患者32例，女性患者19例；鳞癌34例，腺癌17例；高分化14例，中分化16例，低分化21例；临床分期：依据1997年国际抗癌联盟(UICC)TNM分期标准，Ⅰ+Ⅱ期36例，Ⅲ+Ⅳ期15例。有淋巴结转移的28例，无转移的23例。

1.2 主要试剂 兔抗人WWOX多克隆抗体(1∶100) ，购自奥博森生物医药有限公司，鼠抗人P53多克隆抗体和第二代即用型免组化ElivisionTM plus免疫组化试剂盒，均购自福州迈新生物技术有限公司。

1.3 方法 常规石蜡包埋，4 μm连续切片。采用免疫组织化学Elivision法，按试剂盒使用说明书进行。切片常规脱蜡入水，3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶，高压锅抗原修复，加入一抗4 ℃过夜，DAB显色，苏木素复染，PBS代替一抗作阴性对照。

1.4 试验结果的观察和判断 本研究中实验组和对照组均由我院病理科资深医师在相同条件下观察每张切片后对结果作出判断。兔抗鼠WWOX多克隆抗体，阳性着色定位于肿瘤细胞质，呈棕黄色颗粒。WWOX蛋白表达的判定[2]：(1)按阳性细胞数的比例评分:0分，0～<5%;1分，5%～<25%;2分,25%～<50%;3分,50%～<75%；4分: ≥75%。(2)以着色的程度评分，1分弱阳性，2分中等阳性，3分强阳性。以上两者之和>1判断为阳性标本。阴性对照以 PBS代替一抗。突变型P53蛋白阳性着色定位于细胞核，呈棕黄色颗粒状或团块状。突变型P53蛋白表达的判定：参照Takahashi 双评分半定量法进行评分[3]，于免疫着色最多区域计数1 000个肺癌细胞。按阳性细胞数所占百分比计分:0分：<10%；1分>10%～<25%；2分25%～<50%；3分50%～<75%；4分≥75%以上。以着色的程度计分:0分:无着色；1分黄色；2分棕黄色；3分棕褐色。着色强度与阳性细胞百分数之和≥3分即为免疫反应阳性。

1.5 统计学方法 所有资料经SPSS l7.0统计软件包进行数据处理。计数资料采用χ2检验或Fisher确切概率法。相关性分析采用Spearman等级相关分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 WWOX蛋白和突变型P53蛋白在NSCLC组织及癌旁正常组织中的表达情况 本实验中，WWOX蛋白在NSCLC组织及癌旁正常组织中阳性表达率分别为25.49%(13/51)和85%(17/20)，在癌组织中的表达低于癌旁组织(χ2=20.851，P<0.01)。突变型P53蛋白在NSCLC组织及癌旁正常组织中阳性表达率为58.8%(30/51)和10.0%(2/20)，突变型P53蛋白在癌组织中的表达显著高于癌旁正常组织，二者差异有统计学意义(χ2=13.833，P<0.01)。

2.2 WWOX蛋白和突变型P53蛋白的表达与NSCLC各临床病理因素的关系 WWOX蛋白在NSCLC组织中，吸烟组明显低于不吸烟组，鳞癌组明显低于腺癌组，有淋巴结转移组明显低于无淋巴结转移组，有显著差异(P<0.05)。WWOX蛋白在高分化、中分化和低分化NSCLC组织中，阳性表达率分别为50.0%、25.0%和 9.5%，三组间比较有统计学意义，其中高分化与低分化组间差异有统计学意义(P<0.01)，而与病人的性别、年龄、及TNM分期无相关性(P>0.05)。突变型P53蛋白在高分化、中分化和低分化NSCLC组织中，阳性表达率分别为 28.57%、68.75%和71.43%，三组间比较差异有统计学意义，其中高分化与中低分化组间有极显著性差异(P<0.01)，只有中分化与低分化组间无统计学意义；突变型P53蛋白在TNM分期Ⅰ+Ⅱ与Ⅲ+Ⅳ组间差异有统计学意义(P<0.05)；有淋巴结转移的NSCLC组织中，突变型P53蛋白阳性表达率高于无淋巴结转移者，两组间差异有统计学意义(P<0.05)，而与病人的性别、年龄、吸烟史及病理类型无相关性(P>0.05)。见表1

表1 WWOX蛋白在NSCLC中的表达与临床病理参数的关系[n(%)]

2.3 NSCLC组织中WWOX蛋白、突变型P53两者表达的相关性 本组51例NSCLC组织中，WWOX、突变型P53均阳性占7.84%(4/51)，WWOX阳性、突变型P53阴性占17.65%(9/51)，WWOX阴性、突变型P53阳性占50.98%(26/51)，WWOX、突变型P53均阴性占23.53%(12/51)，P<0.05，r=-3.33，两者的表达存在负相关。

3 讨 论

本实验中在NSCLC组织中WWOX蛋白表达缺失率为74.51%(38/51)，显著高于癌旁正常组织中的15%(3/20)，二者之间差异有统计学意义(P<0.01)。即使NSCLC组织中有WWOX蛋白表达 ，表达强度也显著低于癌旁正常组织，提示在NSCLC的发生可能与WWOX基因的表达缺失有关。WWOX基因在许多肿瘤中表达减弱或消失，常表现为等位基因的纯合性缺失、杂合性缺失和基因突变有关。其中肿瘤中WWOX 基因发生杂合性缺失更为常见。发生位点通常为 D16S3029、D16S3096、D16S504、D16S516及D16S518。在胃癌中杂合性缺失发生率45.7%[4]、食管鳞状细胞癌中发生率41.4%[5]。这种缺失不仅与肿瘤的发生呈正相关性，还与TNM分期密切相关。甲状腺癌中WWOX基因282位点 (rs3764340)发生突变，脯氨酸突变为丙氨酸，引起WWOX启动子及外显子超甲基化，显著提高了发生甲状腺癌的几率[6]。E.M.Lange[7]用全基因组连锁分析方法发现WWOX rs1079635位点的突变可能是前列腺癌的易感性因素。K.S.Higginbotham[8]等研究中发现WWOX基因的错义突变与乳腺癌的临床分期、肿瘤直径、淋巴结转移数目有显著相关。本实验中WWOX的表达缺失与组织分化程度，组织学类型相关(P<0.05)，与吸烟显著相关(P<0.01)。在肺癌组织中，男性鳞癌患者WWOX蛋白表达要明显低于女性腺癌患者，吸烟患者明显低于不吸烟患者，这可能与烟草中的致癌因素促进WWOX甲基化所致。给予DNA甲基化转移酶抑制剂 5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)刺激后可使 WWOX 的表达逆转，从而抑制细胞增殖[9]。WWOX蛋白表达缺失率随组织学分级的增高而显著提高，提示WWOX基因表达的缺失与肿瘤的恶性程度有关。因此WWOX基因表达水平的下降可视为早期诊断NSCLC的分子标记物。C.Lan[10]等的研究显示卵巢癌的WWOX mRNA的表达情况与孕激素、雌激素的水平，淋巴结转移能力以及FIGO分期密切相关。在WWOX基因剔除小鼠中，出现明显的生殖系统的形态学改变、繁殖能力显著减退[11]；雌性小鼠下丘脑促卵泡生成素及黄体生成素激素水平显著降低，检测发现雄性小鼠输精管萎缩、生殖功能下降[12]；均提示 WWOX 可能与甾体激素代谢密切相关。本实验结果中，有淋巴结转移的28病例中WWOX表达缺失为25例(89.29%)，而23例无淋巴结转移的病例中WWOX表达缺失仅为13例(56.52%)，WWOX蛋白表达与NSCLC是否伴有淋巴结转移密切相关，伴有淋巴结转移的WWOX基因失表达率明显高于没有淋巴结转移的患者，这对于评价NSCLC转移具有指导意义。Y.L.Zhou[13]等通过基因转染方法，将WWOX基因转染至WWOX基因阴性表达的肺癌细胞之后发现，癌细胞的增殖能力明显减弱、凋亡指数明显增加、克隆集团形成能力和体内成瘤能力明显减弱。可见，WWOX蛋白表达的高低与患者的临床病理及预后密切相关。张继平[14]发现，WWOX蛋白表达与肿瘤组织分化程度、浸润深度、有无淋巴结转移呈正相关。

在本实验中我们观察到，突变型P53蛋白在NSCLC中高表达，而WWOX在NSCLC组织中表达减低或缺失。WWOX蛋白与野生型P53是压力刺激感应下的凋亡所必须的基因，在介导凋亡途径中发挥协调作用，在紫外线、茴香霉素UV等诱导凋亡刺激因素等作用下，JNK1瞬时激活，可抑制WWOX蛋白的表达，并且P53蛋白稳定性下降[15]。在应激凋亡过程中，WWOX蛋白还通过与JNK1、P53等细胞因子相互作用形成异源三聚体。因此，联合检测WWOX基因与P53基因对NSCLC的临床早期诊断、恶性程度和预后的判定均具有重要的指导作用。

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Expression of WWOX protein and mutant type P53 protein in non-small cell lung cancer and its clinical significance

WangJun.

TheFirstHospitalofChuzhouCity,Chuzhou239000,China.

Objective To investigate the relationship between the expression and the clinicopathological factors of WWOX and P53 protein in the tissue of non-small cell lung cancer (NSCLC) and paracancerous tissues. Methods Immunohistochemieal staining methods were used to respectively detect the expression of WWOX and P53 protein in 51 cases of NSCLC and 20 cases of the same cases of paracancer tissues of NSCLC. Results The positive rates of expression WWOX and P53 protein was 25.49 % and 58.82% in NSCLC, whereas in adjacent normal lung tissues it was 85.0% and 10.0%.WWOX expression was strongly associated with tumor histologic and histologic grade, lymph node metastasis,smoking and pathological grade(P<0.05). The expression of WWOX was not related with Age, sex and tumor TNM stage (P>0.05). P53 expression was strongly associated with tumor histologic and histologic grade, lymph node metastasis, and TNM stage(P<0.05). The expression of WWOX was not related with Age, smoking, sex and tumor pathological grade(P>0.05). WWOX was negative relation with the expression of P53 in NSCLC carcinomatissues(r=-3.33，P<0.05). Conclusion The expression of wwox protein and P53 protein in NSCLC and paracanerous, there are statistical significantly differences. WWOX and P53 protein might play synergetic role in the process of carcinogenesis of NSCLC. Determination of their expression might be used to evaluate prognosis.

NSCLC； WWOX； P53； Immunohistochemistry

R734.2

A

1000-744X(2016)03-0246-03

2015-10-23)