结核分枝杆菌效应T细胞检测在诊断活动性结核病中的价值

李根 李春玲 李海聪 赵慧敏 李锋 胡志东 卢水华 范小勇 吕建新



结核分枝杆菌效应T细胞检测在诊断活动性结核病中的价值

李根 李春玲 李海聪 赵慧敏 李锋 胡志东 卢水华 范小勇 吕建新

目的 分析结核分枝杆菌效应T细胞检测法在诊断活动性结核病中的价值。方法 选取2015年1—12月来自上海市公共卫生临床中心、上海市肺科医院和沈阳市胸科医院的708例活动性结核病患者、289例非结核肺部疾病患者和55名健康志愿者作为研究对象。将55名健康志愿者和289例非结核肺部疾病患者作为非活动性结核组。活动性结核组包括68例肺外结核患者和640例肺结核患者，肺结核并发肺外结核者归属为肺结核患者；在肺结核患者中有230例患者痰标本的细菌学检查呈阳性，410例痰标本细菌学检查阴性。分离研究对象外周血单核细胞，应用结核分枝杆菌效应T细胞检测试剂盒进行检测，评价该检测方法的诊断效能。结果 结核分枝杆菌效应T细胞检测试剂盒检测活动性结核组的敏感度为81.78%(579/708)；检测非活动性结核组的特异度为79.36%(273/344)；检测健康志愿者的特异度为89.09%(49/55)。在经检测结果为阳性的650例研究对象中，正确检出阳性579例，阳性预测值为89.08%；在所有检查结果为阴性的402例研究对象中，正确检出阴性273例，阴性预测值为67.91%(273/402)；阳性似然比、阴性似然比和正确诊断效率依次为3.96、0.23和80.99%(852/1052)。检测痰检阳性患者的阳性检出率相对更高，为84.78%(195/230)；检测肺结核并发肺外结核患者的阳性检出率为91.49%(43/47)。结论 结核分枝杆菌效应T细胞检测试剂盒对于活动性结核病的诊断具有较高的敏感度和特异度，尤其在肺结核并发肺外结核的患者以及痰检阳性的肺结核患者中效果较好，可用于辅助诊断活动性结核病。

结核； T淋巴细胞； 试剂盒, 诊断； 酶联免疫斑点检测； 评价研究

结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacteriatuberculosis，MTB)感染引起的重大传染性疾病[1]。2016年世界卫生组织(WHO)调查显示，2015年全球结核病新发患者1040万例，死亡140万例[2]。中国第五次全国结核病流行病学抽样调查报告显示，15岁及以上人群活动性肺结核的患病率为459/10万，情况相当严重[3]。

结核病的早期诊断是控制其传播的关键。以记忆性T细胞检测为基础的γ-干扰素释放试验(interferon gamma release assay，IGRA)在发达国家中已被广泛应用于结核病感染的诊断[4]。MTB效应T细胞检测试剂盒(商品名：QB-SPOT)相对于结核感染T细胞斑点试验(T-SPOT.TB)等进口试剂而言，其造价更低，更具有在我国临床中广泛应用的潜在价值。笔者回顾性分析了该试剂盒在我国结核病诊断中的敏感度、特异度、诊断效率等相关指标，为其对于活动性结核病的临床诊断提供一定的理论依据。

材料和方法

1. 对象：选取2015年1—12月来自上海市公共卫生临床中心、上海市肺科医院和沈阳市胸科医院的708例活动性结核病患者、289例非结核肺部疾病患者和55名健康志愿者作为研究对象。收集研究对象的年龄、性别、所患疾病等临床信息。每一位受试者均用肝素抗凝管收集静脉血液至少5 ml，并在4 h之内进行检测。研究对象均经知情同意并签署知情同意书。

2.分组：非活动性结核组包括55名健康志愿者和289例非结核肺部疾病患者。活动性结核组包括68例肺外结核患者和640例肺结核患者，其中，肺结核并发肺外结核者归属为肺结核患者；在肺结核患者中有230例患者痰标本的细菌学检查呈阳性，410例痰标本细菌学检查阴性。所有研究对象均采用MTB效应T细胞检测试剂盒进行检测。

3. 纳入排除标准：(1)活动性结核病确诊标准：患者出现发热、盗汗、咳嗽等典型结核病症状的基础之上，满足下列任意一项：①抗酸涂片镜检阳性。②BACTEC MGIT 960快速培养MTB阳性。③组织活检或病理检测可见典型结核病灶。④影像学检查可见典型结核病征象，且抗结核药物治疗3个月后随访影像学检查可见病灶明显吸收、症状减轻。其中，肺外结核的诊断依据：肺部影像检查未见明显结核病灶，但肺外组织抗酸涂片镜检阳性或MTB培养阳性，或病理检查提示干酪样坏死。(2)活动性结核病的排除标准(满足其中任意一项)：经病灶活检，明确诊断为肿瘤或其他病原体感染，且排除并发MTB感染；影像学检查无明显结核特征，且经非抗结核药物治疗后病灶明显吸收，症状减轻。(3)健康志愿者纳入标准：影像学检查正常，无疾病体征，无结核病接触史。

4.主要试剂和仪器：Ficoll分离液购自天津灏洋生物制品公司；RPMI1640细胞培养基和胎牛血清购自美国Hyclone公司；MTB效应T细胞检测试剂盒由北京金豪制药股份有限公司提供；酶联免疫斑点测定(ELISPOT)读板仪购自北京赛智生物制品公司。

5. MTB效应T细胞检测：参照试剂盒说明书进行，操作步骤如下：(1)使用5 ml肝素或柠檬酸钠抗凝管，采集新鲜外周血标本，注意样本采集后不能冷藏或冷冻，室温储存不应超过4 h；(2)用Ficoll分离液将外周血单个核淋巴细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)分离出来；(3)吸取细胞(2.5×105个/孔)于预包被有γ-干扰素(IFN-γ)包被抗体的96孔板条，加入终浓度为10 μg/ml的MTB特异性抗原[早期分泌抗原靶蛋白6(ESAT-6)、培养滤液蛋白10(CFP-10)、Esx-1底物蛋白(Rv3615c)多肽库]进行刺激，并以仅加入培养基或2.5 μg/ml植物血凝素(PHA)为阴性或阳性对照，于浓度5%的CO2培养箱37 ℃培养18～20 h；(4)孵育完成后，用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗，并依次添加生物素标记的IFN-γ检测抗体、链酶亲和素标记的辣根过氧化物酶(HRP)结合物和3-氨基-9-乙基卡唑(AEC)显色剂；(5)读取板条上的点数。

结果判定标准如下：(1)当阴性对照孔斑点数<6，阳性对照孔≥20，检测孔点数减去阴性孔点数≥6时，判定结果为阳性；(2)当阴性对照孔斑点数>6，阳性对照孔≥20，检测孔点数≥2倍的阴性对照孔点数时，判定结果为阳性；(3)当阳性对照孔斑点数<20，无论阴性孔和检测孔斑点数为多少，都视为无效，需重复检测。

6.统计学分析：采用GraphPad Prism 6.0软件进行分析。计算MTB效应T细胞检测试剂盒的检测效能指标。计算不同细菌学检查结果肺结核患者应用MTB效应T细胞检测试剂盒检测的斑点数，并进行比较；数据为非正态分布，以中位数(四分位数间距)[M(Q1～Q3)]表示，选用秩和检验进行比较，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.检测效能：采用MTB效应T细胞检测试剂盒在活动性结核组708例患者中，成功检出579例，敏感度为81.78%(579/708)；在非活动性结核组中，检测71例阳性，特异度为79.36%(273/344)；其中，在55名健康志愿者中检测6名阳性，特异度为89.09%(49/55)。在检测结果为阳性的650例研究对象中，正确检出阳性579例，阳性预测值为89.08%(579/650)；在所有检查结果为阴性的402例研究对象中，正确检出阴性273例，阴性预测值为67.91%(273/402)。MTB效应T细胞检测试剂盒检测的阳性似然比、阴性似然比和正确诊断效率依次为3.96、0.23和80.99%(852/1052)。

2.不同类型标本检测效能：在708例结核病患者中，包括了470例单一肺结核、56例单一肺外结核、47例肺结核并发肺外结核、135例结核并发其他疾病(包括肾病综合征、糖尿病和艾滋病等)，应用MTB效应T细胞检测试剂盒检测的阳性率依次为：82.98%(390/470)、83.93%(47/56)、91.49%(43/47)和73.33%(99/135)。

3.不同细菌学结果患者检测效能：在640例肺结核患者中，包括有230例细菌学检查阳性，应用MTB效应T细胞检测试剂盒检测84.78%(195/230)为阳性；410例细菌学检查阴性，80.98%(332/410)检测为阳性。其中，细菌学阳性患者中的检出斑点数为64.50(134.00～22.25)个，明显高于细菌学阴性患者斑点数20.00(52.00～5.00)个，差异具有统计学意义(Z=9.28，P=0.004)。

4.对不同类型的肺外结核患者的检测效能：本试验入组的56例肺外结核患者中包括了5例结核性脑膜炎(tubercular meningitis，TBM)、11例结核性腹膜炎(tuberculous peritonitis，TBP)、11例淋巴结结核(lymphatic tuberculosis，LTB)、6例骨结核(bone tuberculosis，BTB)、5例肾结核(renal tuberculosis，RTB)、8例腰椎结核(lumbar vertebral tuberculosis，LVTB)、3例支气管结核(endobronchial tuberculosis，EBTB)、1例皮肤结核(skin tuberculosis，STB)和6例结核性胸膜炎(tuberculous pleuritis，TBPL)。MTB效应T细胞检测试剂盒检测阳性例数依次为4、11、10、3、5、6、3、0、5，总检出率为83.93%(47/56)。

讨 论

IGRA是近年发展起来的一种免疫学诊断新方法，相较于结核菌素皮肤试验(tuberculosis skin test，TST)，其在检测MTB感染方面拥有更好的特异度和敏感度，是筛查和检查结核病的重要手段之一[5-6]。目前，市场中应用最为广泛的是基于酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT)的T-SPOT.TB。但是，进口T-SPOT.TB试剂的检测费用昂贵，因而在一定程度上限制了其在我国多数地区，尤其是在低收入地区中的临床推广[7-8]。MTB效应T细胞检测试剂盒为我国生产，生产成本相对低廉，检测费用仅为T-SPOT.TB的50%左右，因而更适宜在我国推广使用。与T-SPOT.TB不同的是，MTB效应T细胞检测试剂盒选用的抗原除了ESAT-6、CFP10以外，还添加了第3个抗原——Rv3615c。Rv3615c编码在RD1区外，大小及序列与ESAT-6和CFP10类似，也是一种可引起效应T细胞产生IFN-γ的MTB特异性抗原[9]。MTB效应T细胞检测试剂盒将MTB特异性T细胞抗原ESAT-6、CFP10和Rv3615c全长的重叠多肽组成混合肽库作为抗原，对外周血中分离到的PBMC进行体外刺激，结合ELISPOT技术，即可对结核病疑似患者及潜伏感染者的全血样本进行高特异性的筛查[10-11]。

本研究结果显示，MTB效应T细胞检测试剂盒对活动性结核病患者检测的敏感度和特异度与国内外报道的T-SPOT.TB的敏感度和特异度相当[12-15]。此外，笔者还比较了该试剂盒在不同类型结核病中的阳性检出率，其中，在肺结核并发肺外结核患者中的检出率最高，为91.49%；在结核并发其他疾病患者中的检出率最低，仅为73.33%。究其原因，因为在并发其他免疫或代谢性疾病的时候，人体的细胞免疫反应会受到一定程度的抑制，能分泌IFN-γ的细胞数减少，因而降低了这部分并发感染人群的阳性检出率；此结果与Kim等[16]报道的结果相符。在640例肺结核患者中，有230例痰菌检测结果阳性，其分泌IFN-γ的细胞数量明显高于痰检阴性者，其阳性检出率为84.78%，也高于痰检阴性人群的80.98%。痰检阳性的患者由于其体内的MTB载量更多，能诱导体内效应T细胞分泌产生更多的IFN-γ，从而提高了其检出率。在肺外结核患者的检测中，总检出率为83.93%。可见，该检测法也适用于活动性肺外结核患者的体外诊断，特别是对于TBP和LTB等肺外结核具有较高的临床诊断价值。

本研究还存在一定的局限性。在计算特异度指标时，纳入的对照组人群或为被确诊为非活动性结核的肺部感染人群，或为无临床症状的健康志愿者。因缺乏区分MTB潜伏感染与活动性结核病的标准方法，故无法判定所入组的对照人群中是否含有MTB潜伏感染者，可能导致该检测法对于活动性结核病诊断的特异度被低估。

总之，笔者的研究结果表明MTB效应T细胞检测试剂盒在检测MTB感染方面具有较高的特异度与敏感度，对于活动性结核病的体外诊断具有较好的临床应用价值，尤其在痰检阳性的肺结核患者与肺结核并发肺外结核的患者中表现出了较好的诊断准确性。同时，相较于T-SPOT.TB，该检测法费用更为低廉，且具有较高的检测质量，因而更适宜在我国临床中推广。

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(本文编辑：李敬文)

Value ofMycobactriumtuberculosis-specific effector T cell assay in diagnosis of active tuberculosis

LIGen*,LIChun-ling,LIHai-cong,ZHAOHui-min,LIFeng,HUZhi-dong,LUShui-hua,FANXiao-yong,LYUJian-xin.

*SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325035,China

s:FANXiao-yong,Email:xyfan008@fudan.edu.cn;LYUJian-xin,Email:jxlu313@163.com

Objective To evaluate the value ofMycobactriumtuberculosis-specific effector T cell assay in diagnosis of active tuberculosis (ATB). Methods A total of 708 ATB patients, 289 non-tuberculosis (Non-TB) patients and 55 healthy controls were recruited from Shanghai Public Health Clinical Center, Shanghai Pulmonary Hospital and Shenyang Chest Hospital between January 2015 and December 2015 and were then tested by theMycobactriumtuberculosis-specific effector T cell assay. Non-active tuberculosis (NATB) group included 55 heathy individuals and 289 Non-TB patients. And 708 ATB patients included 640 cases of pulmonary tuberculosis (PTB) and 68 cases of extra-pulmonary tuberculosis (EPTB), in which the patients suffered from PTB complicated with EPTB were classified into PTB cases. Of the PTB cases, 230 were positive and 410 were negative in sputum smear test. The peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were separated and then detectedMycobactriumtuberculosis-specific effector T cell assay to evaluate its value in diagnosis of ATB. Results The results showed that the sensitivity ofMycobactriumtuberculosis-specific effector T cell assay in the ATB patients was 81.78% (579/708); the specificity ofMycobactriumtuberculosis-specific effector T cell assay in the Non-TB patients and healthy controls were 79.36% (273/344) and 89.09% (49/55), respectively. Among all the 650 positive cases, 579 were detected correctly and the positive predictive value was 89.08%; while of the 402 negative cases, 273 were detected correctly and the negative predictive value was 67.91%. Additionally, positive likelihood ratio (LR+), negative likelihood ratio (LR-) and diagnostic efficiency ofMycobactriumtuberculosis-specific effector T cell assay were 3.96, 0.23 and 80.99% (852/1052), respectively. Positive detection rate of patients with sputum smear positive was relatively higher (84.78% (195/230)), and positive detection rate of PTB combined with EPTB was 91.49% (43/47) when tested by theMycobactriumtuberculosis-specific effector T cell assay. ConclusionMycobactriumtuberculosis-specific effector T cell assay has shown a high sensitivity and specificity in detection of ATB, especially in the PTB combined with EPTB cases, PTB cases with bacterial-positive results, it could be adjunctive to the diagnosis of ATB.

Tuberculosis; T-lymphocytes; Reagent kits, diagnostic; Enzyme-linked immunospot assay; Evaluation studies

10.3969/j.issn.1000-6621.2017.05.016

“十二五”国家科技重大专项(2013ZX10003007-003)；国家自然科学基金(81273328、31170876)；上海市科学技术委员会科研计划项目(17ZR1423900、134119a5200)

325035 温州医科大学检验医学院 生命科学学院(李根、李春玲、范小勇、吕建新)；上海市(复旦大学附属)公共卫生临床中心(李海聪、赵慧敏、李锋、胡志东、卢水华、范小勇)

范小勇，Email：xyfan008@fudan.edu.cn；吕建新，Email：jxlu313@163.com

2016-12-21)