基于鼠精细胞的味觉阻抗传感器用于苦味物质检测的研究

田玉兰，苏凯麒，邱先鑫，方佳如，秦 臻，李 蓉，王 平

（浙江大学生物传感器国家专业实验室，生物医学工程教育部重点实验室，生仪学院，杭州310027）

基于鼠精细胞的味觉阻抗传感器用于苦味物质检测的研究

田玉兰，苏凯麒，邱先鑫，方佳如，秦 臻，李 蓉，王 平*

（浙江大学生物传感器国家专业实验室，生物医学工程教育部重点实验室，生仪学院，杭州310027）

本文设计了一种基于雄鼠精细胞的细胞阻抗传感器用于苦味物质的特异性检测。雄鼠精细胞内含有大量T2Rs受体（G蛋白偶联受体）可以对苦味物质产生特异性响应，苦味受体被苦味物质激活后产生的响应会引起细胞形态骨架的变化，从而可以被细胞阻抗传感器检测。本文探索了实验的最佳细胞密度，检测了苯硫脲和奎宁两种常见的苦味物质的响应，苯硫脲检测范围为10 μmol/L～200 μmol/L，检出限为4 μmol/L；奎宁检测范围为62.5 μmol/L～1 000 μmol/L，检出限为40 μmol/L。传感器阻抗值增量与苦味物质浓度呈一定的线性相关性。此外，论文对该味觉传感器的特异性进行了测试分析，表明了基于细胞传感器的检测方法为代替动物和人的苦味测试提供了一种可能的新的手段。

苦味检测；细胞阻抗传感器；精细胞

苦味识别是生物机体的一种防御机制，由于自然界中很多有毒物质都是苦的，对苦味的识别能有助于动物避免摄入有毒和有害物质，在动物长期进化过程中具有重要作用。因此苦味识别技术在食品安全，环境检测及药物筛选等方面具有重要价值。传统的味觉传感器，或称电子舌［1］，其关键因素在于获取灵敏度高和特异性好的敏感材料以达到在复杂环境下高效检测的结果。然而传统的敏感元件通常面临灵敏度低，检测种类有限的困难。因此仿生味觉传感器中的细胞传感器以其高度的生物特异性及灵敏度受到广泛关注。但仿生传感器存在受体细胞难以获取和细胞与器件的耦合问题。

苦味受体细胞是表达有苦味受体的一类特殊的细胞，主要在口腔味蕾的受体细胞内表达［2-4］。同时，研究表明，在小鼠睾丸组织中也有大量的苦味受体基因的表达［5-8］。苦味受体是一类7次跨膜的G蛋白偶联受体（GPCR）中的T2Rs家族（第二类味觉受体家族），对苦味物质具有高度特异性［6，9］。苦味受体被相应配体及激动剂激活后，通过特定信号转导通路，产生细胞级联反应，如细胞形态，生理及膜电位变化［3］。细胞阻抗传感器是一种可以通过检测电极之间的阻抗变化来反映生长在电极之上的细胞的形态变化的传感器，具有长期无侵入监测细胞生长及形态变化的特点，研究表明阻抗传感器可以检测GPCR被激活后引起的细胞形态变化［10-11］。

基于以上论述，本文提出采用雄鼠精细胞作为味觉细胞传感器的敏感材料，细胞阻抗传感器作为二级传感器来检测苦味物质的方法，由于睾丸内存在大量游离的生殖细胞，因此作为构建细胞传感器敏感单元的细胞源具有明显优势，并且相对于表达在异源系统的苦味受体细胞系，原代生殖细胞能对苦味产生更为特异的细胞响应。细胞阻抗传感器用于苦味受体被激活后引起的细胞形态的变化。因此，利用雄鼠精细胞对苦味物质进行检测，苦味物质引起精细胞的形态变化将被阻抗传感器以阻抗的形式表现出来，从而实现对苦味物质的检测。该方法灵敏度高，细胞易获取且操作简单，因此在代替动物和人进行苦味物质的检测的方面具有广泛应用的潜力。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

试剂：HS培养液：135 NaCl，5 KCl，2 CaCl2， 1 MgCl2，30 HEPES（生物缓冲剂），10 glucose（葡萄糖），10 lactic acid（乳酸）和1 pyruvid acid（丙酮酸），单位 mmol/L，用 NaOH调节 pH至 7.4；5 mg/mL BSA溶液（稀释液为HS溶液）；25%乌拉坦；Cell-Tak试剂（细胞粘合剂）；苯硫脲（PTC），奎宁（Quinine），苯甲地那铵（Dena），柠檬酸（CA），蔗糖（Suc），食盐（NaCl），谷氨酸钠（MSG），以上试剂均购买自阿拉丁。

仪器：手术剪，镊子，均购买自上海医疗器械（集团）有限公司手术器械厂；22 μm过滤器，购买自Corning（New York，America）；超纯水机，购买自中国香港力康（Heal Force）生物医疗科技控股有限公司；电子天平，购买自METTLER-TOLEDO（Zurich，Switzerland）。

1.2 系统检测原理

细胞电极阻抗传感，由 Giaever和 Keese在1984年首次提出，是一种可用于监测离体培养细胞行为的传感器［12-13］。细胞在ECIS传感器电极上的贴附、生长和死亡等可以改变电极的电场分布从而引起电阻抗的变化。传感器通过检测电极间的阻抗变化可以实时监测细胞贴附及细胞形态变化［14］。由于细胞阻抗传感器具有无标记，非侵入，可定量，实时的优点，常用于监测细胞贴附及形态变化的实验过程，检测细胞生长，贴附及凋亡，在药物筛选，细胞毒性观测上有广泛应用［15］。图1为传感器的检测原理图和检测系统。

图1 基于雄鼠精细胞的阻抗传感器的检测系统介绍

图1A为8周左右的雄鼠经过麻醉后取雄鼠精细胞用于后续实验。图1B为传感器检测苦味物质浓度的检测原理，精细胞贴附于叉指电极表面，当加入苦味物质时，由于苦味物质与苦味受体结合激活GPCR蛋白导致细胞形态的变化，该变化会反映到细胞-电极之间的电阻变化，通过阻抗即可表现出加入苦味物质浓度的变化。图1C传感器电路检测系统原理示意图：主要包括信号发生模块、前置放大滤波模块、模数转换模块和中央处理器模块［16-17］。检测系统通过信号发生模块产生微小的正弦电压信号，并将这个微小的电压信号加载在多通道传感器上，会在传感器叉指电极上形成离子电流，传感器输出电流经过放大和滤波模块，被数模转换模块采集，最后通过激励信号的幅值和输出电流的幅值，即可计算出每个通道的阻抗大小。图1D为本实验室的16通道检测仪器及阻抗板的实物。图1E为上位机测量系统，用于实时显示阻抗的变化。

在利用阻抗对细胞状态进行测量时，常使用细胞指数来表征细胞的状态［18-19］，其中细胞指数与阻抗之间的关系如下：

式中，CIk(t)表示k通道的细胞在t时刻的细胞指数，Zk(t)表示k通道在t时刻的阻抗值，Zk(0)为k通道检测的初始点的阻抗值，Zk为k通道的腔内阻抗值，为了进一步检测苦味物质的浓度变化对细胞的影响，我们引入归一化细胞指数的概念，归一化细胞指数与细胞指数的关系如下：

式中，NCIk(t)表示k通道的归一化细胞指数，CIk(t)表示k通道的t时刻的细胞指数，CIk(tn)表示k通道归一化点tn的细胞指数值。

利用NCIk(t)的值随不同溶液浓度的变化而变化即可以检测所加溶液的浓度。

1.3 方法

1.3.1 阻抗板的包被

阻抗板用Cell-Tak溶液包被，放置于4℃环境下过夜或者37℃环境下放置1 h，实验前吸干残余液，晾干阻抗板，备用。

1.3.2 雄鼠精细胞提取

手术剪消毒；选用一只8周左右的野生型的雄鼠，用25%乌拉坦腹腔注射麻醉；用镊子及手术剪取出两侧睾丸，去除脂肪垫、白膜及血管，将曲细精管置于HS溶液中；用HS溶液将曲细精管吹打洗涤3次使其分散以及除去血细胞和间质细胞；用镊子将曲细精管剪碎呈半液体状态，置于含有5 mg/mL BSA（bovine serum albumin）的HS培养液中；用吸管反复吹打组织碎片，用过滤网除去组织碎片，分离精细胞；700 r/min离心1 min，将包含大量精细胞的上清液分离出来；稀释20倍后计数，细胞溶液用培养基稀释至400万个/mL；将所得精细胞溶液接种在2个8孔阻抗板中，每孔180 μL；将接种后的两板细胞载入EICS-16系统中，放置于37℃的培养箱中开始检测；120 min（阻抗信号平稳）后加药进行检测。

1.3.3 细胞密度探索

我们对不同细胞密度下精细胞阻抗传感器的灵敏度进行了探索，分别测试了在10万个/mL、50万个/mL、100万个/mL、200万个/mL、400万个/mL、600万个/mL的细胞密度下传感器对200 μmol/L的苯硫脲（PTC）的响应。

1.3.4 苦味物质浓度的测试

奎宁：使用HS缓冲液配制浓度为5 μmol/L，20 μmol/L，62.5 μmol/L，125 μmol/L，250 μmol/L，500 μmol/L，1 000 μmol/L，2 000 μmol/L的奎宁溶液，待传感器细胞阻抗平稳后加入不同浓度溶液，每个浓度做四组实验。

PTC：使用HS缓冲液配制浓度为0.4 μmol/L，2 μmol/L，10 μmol/L，25 μmol/L，50 μmol/L，100 μmol/L，200 μmol/L，1 000 μmol/L，2 000 μmol/L的PTC溶液，待传感器细胞阻抗平稳后加入不同浓度溶液，每个浓度做四组实验。

1.3.5 特异性测试

为了考察传感器对于苦味物质的特异性，我们分别检测了雄鼠精细胞阻抗传感器对1 000 μmol/L的苯甲地那铵（Dena），柠檬酸（CA），蔗糖（Suc），食盐（NaCl），谷氨酸钠（MSG）以及HS溶液的响应。

2 结果与讨论

2.1 密度探索结果分析

图2（a）为不同细胞密度下雄鼠精细胞在阻抗板上面的贴附情况图，图2（b）为不同细胞密度下传感器对 200 μmol/L的 PTC溶液的阻抗响应曲线。

由图2（a）可看出细胞贴附数量随着加入溶液的细胞密度的增加而增加，当细胞浓度在10万个/mL到400万个/mL之间时，其贴附数量逐渐增加，到400万个/mL时基本上整个金电极表面几乎都有细胞贴附，600万个/mL与400万个/mL浓度下细胞的贴附数量无太大变化，其细胞贴附面积与每孔电极面积的比值分别为1%、10%、40%、75%、95%和96%。图2（b）表明对于浓度为200 μmol/L的PTC溶液，不同细胞浓度下传感器的响应幅度存在差异，当细胞种植密度在400万个/mL以下时，其响应幅度随着细胞密度的增加而增加，当细胞种植密度大于400万个/mL时，其响应与400万个/mL相比无明显增加，因为当细胞种植密度在400万个/mL左右时，精细胞几乎在整个金电极表面均有贴附，再增加种植密度，贴附细胞数量并不会显著增加。可因此我们选择400万个/mL作为实验时的细胞溶度。

图2 贴附情况和阻抗响应曲线

2.2 苦味物质测试结果分析

图3（a）为精细胞阻抗传感器对不同浓度PTC溶液的实时响应曲线，右图为细胞-电极阻抗变化值与奎宁浓度之间的拟合关系（mean±SD，n=4）其中mean为平均值，SD为标准差，n为实验次数，右图表明PTC的浓度响应在10 μmol/L～200 μmol/L内呈线性关系，其线性方程为y=0.11x-0.07，线性相关系数为0.95。检测限通过计算空白响应标准差的3倍计算得出，大小为4 μmol/L。

图4（a）为精细胞阻抗传感器对不同浓度奎宁溶液的实时响应曲线，右图为细胞-电极阻抗变化值与奎宁浓度之间的拟合关系（mean±SD，n=4），图4（b）表明奎宁的浓度响应在67.5 μmol/L～1 000 μmol/L内呈线性关系，其线性方程为y=0.05x-0.09，线性相关系数为0.96。检测限通过计算空白响应标准差的3倍计算得出，大小为40 μmol/L。

图3 苦味PTC阻抗响应曲线及其标准曲线

图4 苦味奎宁阻抗响应曲线及其标准曲线

2.3 系统特异性分析

为了考察传感器对于苦味物质的特异性，我们分别检测了该传感器对1 000 μmol/L的Dena，CA，Suc，NaCl，MSG以及Buffer溶液的响应，结果如图5所示。图5为数据进行Student’st检验，可以得出传感器对Quin的响应显著高于其他几种味觉化合物（P＜0.05）。这是因为精原细胞中有大量的苦味受体蛋白的表达，因此精细胞对苦味物质的响应具有特异性，而精细胞内没有其他几种味道的受体，因此对其他物质的响应很小。

图5 阻抗响应曲线和特异性检测分析结果

3 结论

本文构建了一种基于鼠精细胞的阻抗传感器用于苦味物质的特异性检测。该方法结合了雄鼠精细胞对苦味物质具有特异性响应和细胞阻抗传感器实时无侵入测量细胞生长、贴附、形态变化的特点，提出了一种检测苦味物质的新方法。我们探索了使细胞贴附在电极上的方法，实验最佳细胞密度。实验结果表明，该方法对PTC线性检测浓度范围为10 μmol/L～200 μmol/L，检测限为4 μmol/L；奎宁检测范围为线性62.5 μmol/L～1 000 μmol/L，检测限为40 μmol/L。此外，通过检测传感器对其他不同味觉物质的响应，表明这种方法对苦味物质具有特异性的响应。与传统的味觉传感器比较，该方法具有灵敏度高、特异性好、并且细胞易获取的优点，此外，采用的仿生细胞传感器的检测方法在代替动物和人实现苦味物质的检测方面具有广泛应用的前景。

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田玉兰（1990.04），女，浙江大学生物医学工程2014级硕士研究生，从事生物医学工程与生物医学传感器研究，cnyltian@ zju.edu.cn；

王 平（1962-），男，浙江大学，教授，博士生导师，主要研究方向为传感器与检测技术、生物芯片与生物电子学、人工嗅觉与人工味觉等，cnpwang@zju.edu.cn。

A Study on Mouse Germ Cell-Based Sensor for the Detection of Bitterness

TIAN Yulan，SU Kaiqi，QIU Xianxin，FANG Jiaru，QIN Zheng，LI Rong，WANG Ping*
（Biosensor National Special Laboratory，Key Laboratory for Biomedical Engineering，Ministry of Education，Department of Biomedical Engineering，Zhejiang University，Hangzhou310027，China）

In this study，the feasibility of utilizing male mouse germ cells in testis and electrical cell-substrate impedance sensor（ECIS）was explored to build a cell-based bitter biosensor，which can sensitively and specifically respond to bitter compounds.Male mouse germ cells express lots of bitter receptor T2Rs（G protein coupled receptors）which can sensitively and specifically respond to bitter compounds，when active by ligands will affect cell morphology in a specific manner.The best cell density was explored；cell-impedance response profiles of germ cells to two bitter compounds were investigated by analyzing the response intensity under various concentrations，The linear detection range of PTC is 10 μmol/L～200 μmol/L，the detection limit is 4 μmol/L；the linear detection range of quinine is 62.5 μmol/L～1 000 μmol/L，the detection limit is 4 μmol/L； Furthermore，impedance responses to five basic tastes were examined to evaluate the specificity of cell-based bitter biosensor in bitter detection.The results revealed that this hybrid bitter biosensor could respond to those bitter compounds in a dose-dependent manner.And it could respond to bitter compounds specifically.This biosensor may provide a promising approach for detecting various bitter compounds.

biosensor；bitter taste receptor；electrical cell-substrate impedance sensor；male mouse germ cells

R318

A

1004-1699（2016）12-1785-06

��7230J

10.3969/j.issn.1004-1699.2016.12.001

2016-04-25修改日期：2016-07-18