皮肤的光-污染物应激：UVA1和空气污染物协同破坏角质形成细胞氧化还原内稳态的机制研究

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皮肤的光-污染物应激：UVA1和空气污染物协同破坏角质形成细胞氧化还原内稳态的机制研究

近年来，随着人们对污染物危害认识（心肺疾病等）的不断加深，人们对环境空气污染的研究兴趣也在日益增加，但空气污染与皮肤健康的相关研究则相对有限。近期，有临床数据表明，空气污染物中的超细颗粒物（UFP）可通过加剧皮肤炎症反应来加重特应性皮炎患者的病情。欧莱雅在墨西哥展开的一项临床研究表明：空气污染可导致皮肤屏障功能下降、皮脂分泌量增加以及皮脂成分改变等，但迄今对皮肤健康影响的具体机制仍不清楚。原因之一是空气中的污染物种类繁多，难以逐一检测。

如今我们都知道“颗粒物（PM）”这个概念，主要由工业活动产生，一般直径大于几微米，例如，PM10（中值尺寸约为10 μm），通常含有一些矿物质成分，包括各种金属等。而来自木材/煤炭燃烧和柴油燃烧废气的颗粒物的粒径则较小，例如，PM2.5（中值尺寸约为2.5 μm）和超细颗粒物（直径＜100 nm）。这些细小的颗粒物能够携带重金属和多环芳烃（PAH）等有毒物质，成为空气污染主要的有害组成。

到目前为止，PM对皮肤健康的影响未有详细描述，而真实污染环境中，人体皮肤的PAH水平也未见发表。污染物除了能够直接接触皮肤，还能够通过系统途径（食物、呼吸）进入体内并通过血液循环重新到达皮肤。有研究测量，单人每天可通过食物约摄入3.7 mg的PAH。富含PAH的超细颗粒物能够沉积在肺泡中，通过上皮屏障转移到肺部的毛细血管内。一项体内研究发现，煤烟上吸附的BaP（一种PAH）在被人体吸入后，1 h内即可进入血液循环，其危害可持续数周。目前检测到的血清内致癌化合物（如BaP代谢产物）平均浓度都在纳摩尔范围内。另外一些研究人员关于尿液里和毛干内PAH代谢物的定量和定性的评估研究也进一步提示和强调了环境污染物还可能从体内对皮肤进行伤害。此外，具有UVA光反应性的一些PAH还能够加剧颗粒物对皮肤的损伤。事实上，早在几十年前就有研究发现了PAH体外的光毒性，特别是BaP。近期报道，长波UVA（UVA1：340～400 nm）可诱导皮肤基底层角质形成细胞发生氧化应激或DNA损伤等多种伤害。也有学者观察到，UVA1还能特异性诱导MMP-12（弹性蛋白酶）合成上调，表明该波段与皮肤光老化联系紧密。另外微量PAH的光活化还可加重UVA1所诱导的皮肤氧化应激。

该研究旨在了解人角质形成细胞在体外同时接触PAH（环境污染物替代模型）和日光照射会涉及到的一些环境应激相关机制。该研究所使用的PAH浓度与报道的人血液内实际PAH浓度相似。在大多数实验中所用的PAH浓度是在纳摩尔范围内，且研究中使用的UVA1照射剂量都相当于日光中UVA1的剂量。

一、材料和方法

参见原文。

二、结果

1.日常UV（或UVA1）和PM（或颗粒物提取物PME或PAH）协同作用诱发细胞光毒性的比较：该研究选择的UVA1波段为350～400 nm。研究比较了7.5 J/cm2的dUV或UVA1照射下PM和PME对角质形成细胞的细胞光毒性，结果发现，PME和PM细胞光毒性的最低浓度分别为1.9 mg/ml和25 mg/ml。PME较强的细胞光毒性可能反映了PAH的组成及其生物利用度。已知PME对UVB和UVA2的吸收率较高，但日光中各波段对细胞的存活率影响却都相似。所以，可推测UVA1是导致研究中角质形成细胞细胞光毒性的主要原因，究其原因可能是UVA1的光谱波段可激发几种具有光反应性的化学物质。

研究还对一些常见的PAHs（如菲、荧蒽、二苯并蒽、BaP和IcdP）进行了UV照射试验。结果发现，对UVB/UVA有同样吸收能力的BaP和IcdP与UVA1协同作用，在极低浓度下即可导致细胞的光毒性（相比其他几种PAH），且比与dUV协同作用强度更大。由于BaP和IcdP是纳摩尔级的光敏剂，因此可以解释PM和PME的UVA1光毒性。考虑到MTT Assay取决于细胞代谢的活性，因此研究使用细胞计数来作为细胞光毒性的第二指标，结果发现细胞计数结果与MTT数据一致。除了上述单层细胞培养所观察到的结果，研究还求证了在体外重建皮肤模型中该结果的重现情况。证实在多次照射方案下，低浓度的BaP和IcdP同样会引起体外重建表皮模型的细胞光毒性。与此同时，在体外重建表皮模型的培养基内加入BaP和IcdP后进行UVA1照射，还能检测到与照射剂量呈正相关的组织损伤，特别是在基底层上层。该结果进一步强调，在UVA1的协同作用下，皮肤深层的角质形成细胞对BaP和IcdP的系统性暴露（通过血液循环等）可能会破坏表皮的内稳态。

研究人员还希望了解当PAH+UVA1协同作用未致细胞死亡的时候，该协同应激是否会破坏角质形成细胞的增殖。于是使用集落形成效率测试（CFE）来进行评估。结果发现BaP会损伤角质形成细胞的CFE（IcdP的影响较弱）但不会导致细胞的死亡。事实上，5 nmol/L的BaP和UVA1协同作用角质形成细胞所长出的细胞集落虽然与空白对照组的数量相似，但细胞集落的大小却明显较小，提示细胞的增殖能力受损。5nmol/L的IcdP结果也与其相似。因此，BaP和IcdP与UVA1共同处理角质形成细胞可能破坏表皮的更新。50 nmol/L（细胞光毒性剂量）的BaP或IcdP作用能够显著降低细胞克隆的集落数量，导致细胞死亡。更重要的是，HPLC/荧光染色分析结果发现，与细胞光毒性相关的BaP或IcdP浓度远低于预期（小于理论浓度20%），可能是由PAH-plastic相互作用导致。该结果表明，研究所检测的BaP和IcdP光毒性浓度范围与文献中报道的血浆内浓度一致，并且更低。

2.线粒体参与BaP和IcdP诱导的光氧化应激过程：据报道，PAH的光反应产物是各种活性氧簇（ROS），另外UFP能通过细胞摄入损伤线粒体。欧莱雅早前的临床研究显示：生活在空气污染较重地区的居民其角质层细胞内ATP的含量会减少（相比较轻的空气污染环境）。因此，研究也检测了极低浓度的PAH是否会诱导线粒体应激。事实上，研究在照射后能立刻观察到DHR-123探针所发出的强荧光，说明BaP和IcdP能够增强UVA1诱导的细胞内氧化应激。此外，还检测到线粒体膜的去极化（MMD）和线粒体内超氧化物的产生，而在暗室中单独加入PAH或单独使用UVA1照射都不会产生上述结果（数据未显示）。有意义的是，相比IcdP+UVA1，BaP+UVA1对MMD和超氧化物的产生的影响并不显著，但对ATP合成的影响较强。这些结果表明，低浓度的两种PAHs能够催化UVA1照射下细胞内ROS的产生；同时还提示它们可能会有针对性的导致线粒体损伤，但BaP和IcdP对线粒体的损伤机制可能不同。

3.BaP/IcdP±UVA1激发谷胱甘肽的代谢反应：还原型谷胱甘肽（GSH）在细胞氧化还原内稳态中起着至关重要的作用，特别是在线粒体内。另外它会参与PAH在体内的解毒过程。研究在PAH+UVA1协同作用角质形成细胞的条件下，追踪检测细胞内GSH的水平。随BaP或IcdP浓度的增加，观察到UVA1照射后5 h细胞内GSH水平呈显著且缓慢降低，18 h后GSH又恢复初始水平。为了进一步评估GSH对细胞的保护作用，在接受PAH+UVA1处理前，对NHEK进行丁硫氨酸亚砜氨酸（BSO）预处理，BSO是GSH生物合成的抑制剂。发现BSO预处理能够显著减少UVA1+BaP（3 nmol/L和6 nmol/L）和UVA1+IcdP（15 nmol/L和30 nmol/L）处理后角质形成细胞的活力，而单独的UVA1照射不会影响BSO预处理后细胞的活力。这个结果突出了GSH可能对PAH+UVA1诱导的NHEK细胞光毒性应激起防护作用。研究还检测了与GSH内稳态相关基因的表达，来了解细胞如何应对氧化还原状态的改变。谷氨酰半胱氨酸连接酶的催化剂（GCLc）和修饰子亚基（GCLm）调控GSH的新合成，谷胱甘肽还原酶（GR）可再产生氧化型GSH，溶质载体家族成员SLC7A11能够编码控制细胞内提供胱氨酸的逆向运转器。结果发现UVA1照射后5 h BaP或IcdP的存在可显著诱导SLC7A11基因表达，18 h后该基因表达减弱（BaP浓度为6 nmol/L和IcdP浓度为30 nmol/L时的结果除外），BaP+UVA1的作用导致了持久地高表达。SLC7A11蛋白也是过度表达，GCLc的表达也受到了轻度刺激，而GCLm和GR则未观察到变化。

三、讨论

该体外研究旨在调查空气污染物和日光照射对皮肤的协同影响。首先，研究选用UVA1作为日光照射波段是因为UVA1约占日光紫外线的80%，不受云层、衣物或玻璃等阻隔，能够到达真表皮层，且全年不同时段和不同纬度的照射能量都相对稳定。另外，研究还使用了纳摩尔水平的PAHs来模拟一些空气污染物对皮肤所造成的潜在危害。研究表明，PM、PME和一些PAHs能够诱导皮肤显著的光毒性应激，且UVA1所诱导的光毒性基本等同于UVB+UVA的合并波段。研究发现，BaP和IcdP在低浓度（nmol/L）下即能表现出极高的细胞光毒性。虽然这种低浓度不会影响细胞的存活率，但其诱导的应激能减小细胞克隆的表面积，影响细胞的克隆形成能力。结果可能导致表皮更新在长期的光-污染应激（photo-pollution stress）下受损，还可能加重UVA1诱导的皮肤光损伤。该研究数据表明，空气污染相关的皮肤异常可能是诸如BaP和IcdP这样的“罪魁祸首”所造成，并能够在极低浓度下增强UVA对皮肤的氧化应激。

在无光照条件下，BaP和IcdP的细胞毒性和代谢效应是有限的；而当细胞同时暴露在UVA1和BaP或IcdP下，能显著破坏细胞的氧化还原内稳态。研究还关注了皮肤细胞中线粒体的损伤情况。PAH+UVA1处理后细胞线粒体内超氧化阴离子的增加也可能促进细胞整体的氧化应激（DHR-123探针可检测到）。线粒体膜去极化可能是由线粒体的直接（或间接）靶向作用所导致，特别是IcdP的作用。此外，ATP合成减少也可能反应了电子传递链的功能障碍，BaP主要在该作用上起效。无论机制如何，可以肯定的是光-污染应激可以破坏皮肤细胞中能量的产生。

机体对光-污染应激的保护之一是内源性解毒机制的启动，如应激发生几小时后细胞内GSH减少。此外，作者还观察到使用BSO破坏了GSH的生物合成后，细胞光毒性的增强。GSH是在胞质溶胶中合成的，一部分被转运到线粒体中。GSH的内稳态是保护线粒体所必需的，这样才能帮助细胞抵御ROS和亲电代谢物。该研究证实了在皮肤遭受光-污染应激时，GSH所起的这种必要的保护作用。另外，PAH和UVA1协同作用可导致角质形成细胞SLC7A11基因和蛋白质的过度表达，该结果表明，GSH的更新主要依赖于胱氨酸的供应，而其他基础酶的活性可能足以应付该实验条件下所产生的应激强度。UVA1和BaP或IcdP协同作用NHEK后5 h可观察到SLC7A11基因表达的显著诱导。当使用低浓度的PAH时，SLC7A11的表达在处理后18 h减少至其初始水平。表明人体基础解毒代谢能够应付轻微的光-污染应激。另一方面，对高浓度、具有光毒性的PAH暴露，角质形成细胞需要更长的时间（＞18 h）进行恢复。角质形成细胞内SLC7A11（mRNA和蛋白质）表达量还是PAH±UVA1诱导氧化应激的有趣标记物，可被视作表皮光-污染应激的早期标记物。

［孔佩慧编译,摘自Soeur J,Belaidi JP,Chollet C,et al.Photopollution stress in skin:traces ofpollutants（PAH and particulate matter）impair redox homeostasis in keratinocytes exposed to UVA1［J］.J Dermatol Sci,2017,86（2）:162-169.DOI:10.1016/j.jdermsci.2017.01.007.］

欧莱雅法国研发和创新中心