淫羊藿苷对大鼠骨髓间充质干细胞迁移作用的影响

张黎声，韩小晶，罗志荣，邵水金，叶晓春，牟芳芳，国海东

上海中医药大学基础医学院，上海 201203

论著·实验研究

淫羊藿苷对大鼠骨髓间充质干细胞迁移作用的影响

张黎声，韩小晶，罗志荣，邵水金，叶晓春，牟芳芳，国海东

上海中医药大学基础医学院，上海 201203

目的探讨淫羊藿苷调控大鼠骨髓间充质干细胞（MSC）迁移作用机制。方法CCK-8法检测细胞增殖。建立体外细胞缺糖缺氧模型，Hoechst33342染色观察细胞凋亡。Western blot检测淫羊藿苷处理后MSC表面基质细胞衍生因子l（SDF-1）受体趋化因子受体4（CXCR4）的蛋白表达。Transwell小室跨膜实验观察淫羊藿苷对MSC迁移的作用。结果0.01、0.1、1 μmol/L淫羊藿苷可明显促进MSC增殖，10 μmol/L淫羊藿苷抑制MSC增殖。经体外缺糖缺氧处理后，0.1、1 μmol/L淫羊藿苷可明显抑制MSC凋亡。淫羊藿苷可显著促进MSC CXCR4的蛋白表达，同时可提高MSC跨膜迁移的数量。加入CXCR4拮抗剂AMD3100后，各组间细胞迁移数量无明显差异。结论一定浓度淫羊藿苷可促进MSC的增殖、存活和迁移，SDF-1/CXCR4信号通路参与淫羊藿苷调控MSC迁移的作用。

淫羊藿苷；骨髓间充质干细胞；存活；迁移；信号通路

干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的原始细胞。在一定条件下，干细胞可以分化成多种功能细胞，成为治疗损伤性疾病极具潜力的疗法。在心血管领域，近年来的临床研究表明，干细胞移植在一定程度上有利于心功能的恢复[1]。我们的研究发现，骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）移植可降低大鼠心肌梗死后梗死面积，促进血管新生和旁分泌[2-3]。然而，心肌梗死后局部微环境不利影响干细胞的存活，也限制了干细胞的迁移[4]。淫羊藿苷（icariin）是一种从淫羊藿中提取的异黄酮类化合物，可补肾壮阳、延缓衰老，增加心脑血管血流量、强心、降血压和抗心律失常[5]。淫羊藿苷不仅可诱导胚胎干细胞向心肌细胞分化[6]，还可以促进细胞增殖和抑制细胞凋亡[7-8]。最近的研究发现，淫羊藿苷可促进血管内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPC）的迁移，但其具体作用机制尚不明确[9]。基质细胞衍生因子l（stromal cell derived factor-l，SDF-l）/趋化因子受体4（CXCL receptor 4，CXCR4）信号通路在干细胞归巢、迁移和募集过程中发挥重要的调控作用[10]。因此，本研究探讨SDF-1/CXCR4信号通路在淫羊藿苷调控MSC迁移中的作用机制，为临床应用干细胞移植治疗心肌梗死等损伤性疾病提供实验数据。

1 实验材料

1.1 动物

SPF级雄性SD大鼠10只，体质量（200±50）g，上海中医药大学实验动物中心，动物许可证号SYXK（沪）2014-0008，购入后直接用于原代MSC培养。

1.2 主要试剂和仪器

胰酶、多聚赖氨酸、AMD3100和牛血清白蛋白（美国Sigma 公司），高糖DMEM和无糖DMEM培养基（美国Gibco公司），胎牛血清（美国Hyclone公司），CCK-8试剂盒、Hoechst33342、PMSF和RIPA裂解液（上海碧云天生物技术有限公司），Transwell小室和24孔板（美国Corning Costar公司），SDF-1α（美国PeproTech公司），CXCR4抗体、GAPDH抗体和HRP标记二抗（美国CST公司）。电泳仪和转膜仪（美国Bio-Rad公司），IX53显微镜（日本Olympus），细胞培养箱（美国Thermo Fisher公司）。

2 实验方法

2.1 骨髓间充质干细胞培养

将成年雄性SD大鼠脱颈处死，无菌条件下分离双侧股骨和胫骨。剪开骨两端的干骺端，暴露骨髓腔，用含有肝素的0.01 mol/L PBS冲洗骨髓腔至10 mL离心管内，1000 r/min离心8 min。吸去上清液，用含15％FBS DMEM培养液混悬沉淀，均匀接种至培养瓶中，37 ℃、5％CO2条件下培养。当细胞达到70％～80％汇合时，进行传代培养。

2.2 CCK-8法检测细胞增殖

取第5代MSC，用0.01 mol/L PBS漂洗后，经0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA混合消化液消化，收集细胞悬液，1000 r/min离心8 min，弃去上清液，加入新鲜培养液重新混悬沉淀后将细胞以5×104个/mL接种至96孔板中。用不同浓度的淫羊藿苷对MSC进行刺激，分为0.001、0.01、0.1、1、10 μmol/L淫羊藿苷组，未加淫羊藿苷处理的作为对照组。加入不同浓度淫羊藿苷处理48 h后，CCK-8法检测各组细胞吸光度（OD）值。取各组细胞，每孔加入10 μL CCK-8溶液，于细胞培养箱内继续孵育1 h后，于酶标仪波长450 nm处测定OD值。

2.3 体外缺糖缺氧模型建立

参照Hori O等[11]方法自制缺氧盒，并加以改进。在有机塑料盒的2个侧面各建立1个通气孔，分别用于进气和排气，将95％ N2和5％ CO2的混合气体通过进气孔通入缺氧盒中，通过排气孔将盒内气体抽空和连接测氧仪。实验分为对照组（未加淫羊藿苷）和0.01、0.1、1 μmol/L淫羊藿苷组。将细胞接种至24孔板内的灭菌盖玻片上，培养24 h后从培养箱内取出24孔板，吸去培养液，用0.01 mol/L PBS漂洗3次，更换无糖无血清的DMEM，淫羊藿苷组分别添加相应浓度的淫羊藿苷进行处理。然后将24孔板放入自制无菌缺氧盒中，密封盒盖，关闭通气孔。通过排气孔用50 mL注射器将缺氧盒中的气体尽可能抽空。然后密封排气孔，经通气孔通入体积分数为5％ CO2和95％ N2的混合气体，并通过测氧仪检测盒中的氧气含量。当缺氧盒内氧浓度低于1％时迅速密封通气孔，然后将缺氧盒置于37 ℃下继续培养。

2.4 Hoechst33342染色

各组细胞经体外缺糖缺氧处理24 h后，弃去培养液，用0.01 mol/L PBS漂洗3次，加入4％多聚甲醛固定20 min，0.01 mol/L PBS漂洗3次后加入Hoechst33342染色液，室温孵育10 min，0.01 mol/L PBS漂洗3次，磷酸甘油封片，荧光显微镜下观察细胞核的形态。每孔随机选取5个视野，分别计数凋亡和全部细胞数。实验重复5次，计算细胞凋亡率。细胞凋亡率（％）＝凋亡细胞数÷细胞总数×100％。

2.5 Western blot检测CXCR4蛋白表达

实验分为对照组和0.01、0.1、1 μmol/L淫羊藿苷组。将MSC接种至6孔板中，不同浓度淫羊藿苷处理48 h，吸去上清液，经0.01 mol/L PBS漂洗3次，每孔加200 μL预冷的含PMSF的RIPA裂解液，充分裂解细胞后12 000 r/min离心15 min，取上清液。BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。取各组蛋白30 μg，加入5×SDS上样缓冲液，于沸水中煮5 min使蛋白变性。上样后行电泳，至溴酚兰刚跑出时终止电泳，经半干转转膜仪转膜，20 V条件下转印60 min，使胶内蛋白充分转移至PVDF膜上。将膜用PBST浸湿后，移至含5％脱脂奶粉的平皿中，室温脱色摇床

巢、黏附、血管穿透和在靶器官内的增殖、存活的整个过程中发挥着重要作用。有研究表明，MSC在体外培养后，其表面受体CXCR4的表达水平逐渐降低，导致MSC向心肌组织的募集减少。研究发现，对急性大脑中动脉梗死大鼠灌胃低剂量淫羊藿苷可显著提高脑组织中SDF-1和CXCR4的表达，促进大鼠脑缺血后的神经功能恢复[16]。因此，移植淫羊藿苷预处理的MSC可能会提高干细胞治疗心肌梗死的效果。

综上所述，一定浓度的淫羊藿苷可促进MSC的增殖、存活和迁移。SDF-1/CXCR4信号通路参与淫羊藿苷调控MSC迁移的作用。本研究可为临床应用干细胞移植治疗心肌梗死等损伤性疾病提供实验数据参考。

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Effects of Icariin on Migration of Mesenchymal Stem Cells of Rat Bone Marrow

ZHANG Li-sheng,HAN Xiao-jing, LUO Zhi-rong, SHAO Shui-jin, YE Xiao-chun, MOU Fang-fang, GUO Hai-dong
(School of Basic Medicine, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China)

ObjectiveTo explore the mechanism of icariin mediating migration of mesenchymal stem cells (MSC) in rat bone marrow.MethodsMSC proliferation was detected by CCK-8 test. Cell apoptosis was examined with Hoechst33342 staining after the establishment of cellular oxygen and glucose deprivation model. The protein expressions of CXCR4, the receptor of SDF-1, in the surface of MSC after stimulated by icariin were detected through Western blot. The migration of MSC was observed by Transwell chemotaxis assay.Results0.01 μmol/L, 0.1 μmol/L and 1 μmol/L of icariin could significantly promote the proliferation of MSC, while 10 μmol/L of icariin inhibited the proliferation of MSC. After treatment of oxygen and glucose deprivation in vitro, 0.1 μmol/L and 1 μmol/L of icariin could inhibit the apoptosis of MSC. Icariin could not only improve the expression of CXCR4 in MSC, but also increase the number of transmembrane migrated MSC. After the addition of CXCR4 antagonist AMD3100, there was no significant difference in the number of cell migration among the different groups.ConclusionIcariin with appropriate concentration can promote the proliferation, survival and migration of MSC. SDF-1/CXCR4 signaling pathway is involved in the regulation of MSC migration by icariin.

icariin; mesenchymal stem cell; survival; migration; signaling pathway

R285.5

A

1005-5304(2017)02-0044-05

2016-06-26）

（

2016-07-12；编辑：华强）

国家自然科学基金（81673729）；上海市自然科学基金（16ZR1437300）；上海市教育委员会科研创新项目（14YZ053）

国海东，E-mail：hdguo8@hotmail.com

DOl：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.02.013