四种白血病细胞血涂片染色方法的比较

李 涛,李文哲,王霖涛,薛瑞冰,孙栾彪,张雨薇,姬新颖

1．河南省核蛋白基因调控国际联合实验室，河南 开封475004； 2．河南大学 基础医学院，河南 开封475004

白血病(Leukemia)，亦称作血癌，是一种造血系统的恶性肿瘤，也是我国最常见的恶性肿瘤之一。白血病患者过分生产不成熟的白细胞，妨害骨髓的正常工作，使得骨髓生产其他血细胞的功能降低，其结果严重威胁患者的生命安全[1-4]。结合临床症状在患者的外周血中检出白血病细胞是确诊白血病的诊断依据。制作结构清晰的白血病血涂片标本对临床诊断和组织学教学具有重要意义[5-7]。由于白血病患者血液中含有过多的未成熟白细胞(即白血病细胞)，实际操作中染色效果多不理想, 影响观察分类与诊断，为寻找较好的血涂片染色方法，我们将四种染色方法用于白血病标本制作，并对染色效果进行比较观察，旨在得到更好的血涂片染色效果。

1 材料与方法

1.1 主要仪器

恒温保温箱，电子秤，秒表，显微镜，载玻片，盖玻片，滤纸，移液器，漏斗，玻璃棒，乳钵乳棒，烧杯，储存瓶，胶头滴管，中性树胶，棉签。

1.2 主要试剂的配制

1.2.1 Wright氏染液 参考《血液细胞学》(第2版)8配制。称取干燥的Wright氏染料0.1 g，甲醇(AR)60 mL。将Wright氏染料放置乳钵内，用乳棒轻轻研磨成粉末；加少许甘油或甲醇溶解研磨，使染料在乳钵内彻底成光滑细致的粉末而无染料粉粒沉着，再加较多量甲醇研磨呈一面镜光亮；静置片刻，将上层液体倒入一清洁棕色瓶内贮存；乳钵内再加甲醇研磨，重复数次，直至乳钵内染料及甲醇用完为止。摇匀，过滤，滤液密封瓶口，存室温暗处，储存愈久，则染料溶解、分解就越好。

1.2.2 Giemsa氏染液[8]配制方法：取Giemsa氏色素染料1 g加入66 mL甘油，混匀，60 ℃保温溶解2 h，再加入66 mL甲醇混匀，放置24 h,过滤，贮存在棕色瓶内，即配成Giemsa氏染液原液。此原液用前用PBS(pH 6.8)稀释10倍左右就可以使用此为Giemsa氏染液工作液。工作液可室温保存1 mon左右。

1.2.3 磷酸盐缓冲液(PBS 6.8) 取0.2 mol/L磷酸二氢钾溶液250 mL，加0.2 mol/L氢氧化钠溶液118 mL，用蒸馏水稀释至1 000 mL，即得。

1.3 标本采集、涂片

白血病血标本取样于河南大学第一附属医院血液病科，诊断为慢性粒细胞白血病患者。使用移液器吸取混匀血样，滴取2 μL血液于洁净载玻片上，用推片在血样前方接触血滴，使血滴均匀呈一直线，推片与载玻片呈45°角，用力均匀将血滴推开，自然晾干。大量制作教学标本可一次推出所需血涂片，晾干待用。

1.4 染色

1.4.1 Wright氏染色法 Wright氏染色法参考《实用组织学技术》(第2版)9。将3片血涂片平放在染色架上，分别加Wright氏染液2～3滴，使之覆盖整个血涂片，染色0.5～1.0 min；滴加等量或稍多的新鲜蒸馏水，与Wright氏染液混匀分别染色10、15、20 min,然后用自来水缓慢从血涂片一端冲洗去染液(注意：勿先倒去染液或直接对血涂片冲洗),待自然干燥后，中性树胶封片，即可放置血涂片于显微镜高倍镜下进行观察。

1.4.2 Giemsa氏染色法 Giemsa氏染色法参考文献[8]。Giemsa氏原液用前用PBS(pH 6.8)稀释10倍左右为Giemsa氏工作染液，此工作染液需要新鲜配制。将3片标本血涂片用无水甲醇固定3 min，滴加Giemsa氏工作液，将血涂片分别染色10、15、20 min。用自来水缓慢从血涂片一端冲洗去染液(注意：勿先倾倒去染液或直接对血涂片冲洗),置于空气中干燥，用中性树胶加盖玻片封片，于显微镜高倍镜下进行观察。

1.4.3 Wright氏-Giemsa氏混合染色法 Wright氏-Giemsa氏混合染色法参考文献[9]。将Wright氏染液∶Giemsa氏工作染液∶磷酸盐缓冲液(PBS 6.8)按照5∶1∶6体积混合均匀。将3片血涂片平放在染色架上，甲醇固定2～5 min,甩干；加混合染液数滴，使之覆盖整个血涂片，分别染色10、15、20 min，取出涂片，然后用自来水缓慢从血涂片一端冲洗去染液(注意：勿先倾倒去染液或直接对血涂片冲洗)。置于空气中自然干燥，用中性树胶及盖玻片封片，放置于显微镜高倍镜下进行观察。

1.4.4 Wright氏-Giemsa氏分步联合染色法 将3张血涂片平放在染色架上，首先加Wright氏染液2～3滴，使覆盖整个血涂片，固定0.5～1.0 min，滴加等量或稍多的新鲜蒸馏水，与染液混匀分别染色10、15、20 min，用自来水缓慢从血涂片一端冲洗去染液。然后滴加Giemsa氏工作染液，将血涂片分别染色10、15、20 min。取出血涂片，再一次用自来水缓慢从血涂片一端冲洗去染液(注意：勿先倒去染液或直接对血涂片冲洗)，置于空气中自然干燥,用中性树胶加盖玻片封片，置于显微镜高倍镜下进行观察。

2 结果

2.1 Wright氏染色

用Wright氏染色法分别染色10、 15、20 min，红细胞呈橘黄色，白血病细胞核呈紫红色，细胞质颗粒呈淡蓝色。染色时间无论长短细胞核均易着色，见图1。

2.2 Giemsa氏染色

用pH 6.8的磷酸盐缓冲液(PBS)配制的工作液，分别染色10、15、20 min，红细胞呈蓝灰色，白血病细胞核呈紫蓝色，中性颗粒浅紫色；而pH<6.8和染色时间较短者，则核难着色，pH>6.8则核呈蓝色，见图2。

2.3 Wright氏-Giemsa氏混合染色

分别染色10、 15、20 min。红细胞呈灰黄色或灰色，白血病细胞核呈紫红色，细胞质颗粒呈灰蓝色或淡紫色，染色时间无论长短则细胞核易着色，细胞核结构清晰，色泽艳丽，见图3。

2.4 Wright氏-Giemsa氏分步联合染色

分别染色10、 15、20 min。红细胞紫粉色，白血病细胞核呈紫红色，细胞质颗粒呈淡蓝色；细胞核结构清晰，色泽明亮透彻干净，富有立体感。染色时间短(10 min)则细胞核难着色，见图4。

3 讨论

血涂片是血液细胞学检查的基本方法，应用极广，特别是对各种血液病的诊断有很大价值。但血片制备和染色不良，常使细胞鉴别发生困难，甚至导致错误结论。例如，血膜过厚细胞重叠缩小，血膜太薄白细胞多集中于边缘，因此，染色良好的血片是血液学检查的基本技术之一[10-12]。

本研究所采用的四种染色法，各有优缺点：Wright氏染色法的优点是染色时间短，结果出现快，较适于临床检验，但其染色过程不易掌握、易污染是其缺点；Giemsa氏染色法的染色液不易污染是其最大的优点，但是，染色效果对染液pH值要求高，较易偏碱，不易控制，经过反复多次试验，以pH 6.8染色效果最好(图2)。Wright氏-Giemsa氏混合染色法虽能对前两种染色法起互补作用，但对红细胞着色不均匀，且染液变性快、易污染，也不适于教学标本染色(图3)。Wright氏-Giemsa氏分步联合染色法的优点是红细胞呈紫粉色，白血病细胞核呈紫红色，细胞质颗粒细腻呈淡蓝色，细胞核结构清晰，色泽明亮透彻干净，富有立体感，着色保持时间久；而缺点是染液变性快、易污染，适合新鲜配制，即适用于大批量制作组织病理学和组织胚胎学教学用片(图4)。

综上所述，我们的体会是：血液标本一定要新鲜；四种血涂片滴加染液后，不要直接倾倒去染液，否则易使染液沉淀在血涂片上，影响结果观察；直接用自来水冲洗比用蒸馏水或缓冲液冲洗更方便、彻底和节约。

图1 不同时间Wright氏染色结果比较

图2 不同时间Giemsa氏染色结果比较

图3 不同时间Wright氏-Giemsa氏混合染色结果比较

图4 不同的Wright氏-Giemsa氏分步联合染色结果比较

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