黄曲霉毒素的生物降解研究进展

2017-02-15 17:13赵春霞王轶吕育财程薇郭鹏崔宗均
湖北农业科学 2016年20期
关键词:微生物

赵春霞+王轶+吕育财+程薇+郭鹏+崔宗均

摘要:黄曲霉毒素(Aflatoxins)是黄曲霉(Aspergillus flavus)、寄生曲霉(Aspergills parasiticus)等真菌的次级代谢产物,具有高毒性和致癌性,是饲料中主要的污染物之一。近年来黄曲霉毒素的降解成为研究热点,对黄曲霉毒素的特性、脱毒方式尤其是生物降解及其机理和降解产物的研究进展进行了综述。

关键词:黄曲霉毒素;生物降解;微生物;脱毒方式

中图分类号:Q936 文献标识码:A 文章编号:0439-8114(2016)20-5172-05

DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.20.002

Abstract: Aflatoxins are the secondary metabolites of Aspergillus flavus and Aspergillus parasiticus,and one of the major toxins in food and feed with high toxicity and carcinogenicity. In recent years,the research on aflatoxins is becoming a hotspot. The review focuses on the characteristics and detoxification methods of aflatoxins,especially the biodegradation process and degradation products.

Key words:aflatoxin; biodegradation; microorganism; detoxification way

黄曲霉毒素(Aflatoxins)最早发现于1960年,当时在英国,大量火鸡因喂食发霉的花生饼粕而死亡,1961年科学家从花生饼粕中培养分离出一种霉菌,经鉴定其为黄曲霉(Aspergillus flavus),后来证实是该菌产生的黄曲霉毒素导致了火鸡突发性死亡[1]。自此,科学家们开始了对黄曲霉毒素的深入研究。黄曲霉毒素主要是由黄曲霉和寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)等真菌产生的一类高毒性的次生代谢物[2]。1993年世界卫生组织(WHO)将黄曲霉毒素划定为1级致癌物质。黄曲霉毒素广泛存在于谷物与饲料原料中。畜禽食用被黄曲霉毒素污染的饲料会引发疾病,通过食物链进入人体的毒素仍然具有高致癌性,严重威胁人类健康。因此,控制和解决饲料和粮食中黄曲霉毒素的污染对人类健康具有十分重要的意义。

由于黄曲霉毒素严重威胁人类健康,不少科学家致力于黄曲霉的脱毒研究。目前已经报道多种物理和化学的脱毒方式,这些脱毒方式在一定程度上可以降低或者消除黄曲霉的毒性。但不论是单独使用或者联合使用这些方式脱毒,都难以达到所期待的安全、高效、低成本和营养成分低损失的效果。而生物脱毒法因具备以上优势而成为黄曲霉毒素脱毒技术的新方向。本研究对黄曲霉毒素的特性、脱毒方式尤其是生物脱毒方式及其机理和生物降解产物等方面进行了综述。

1 黄曲霉毒素的特性

1.1 黄曲霉毒素的结构和性质

黄曲霉毒素大概有20多种结构,这些结构均是双呋喃香豆素的衍生物,基本结构中都有二呋喃环和氧杂萘邻酮(香豆素),前者为基本毒素结构,与黄曲霉毒素的毒性有关,后者与致癌有关,该结构在紫外光照射下可产生荧光。目前已经分离鉴别出的结构主要有发蓝色荧光的B类和发绿色荧光的G类,在粮油制品中主要以B1、B2、G1与G2的形式存在,在动物体内会转化产生M1、M2两种异构体[3]。6种主要的毒素结构如图1。黄曲霉毒素中毒性最强的是黄曲霉毒素B1(AFB1),其次毒性从强到弱依次为M1、G1,B2和G2[4]。因此,对于黄曲霉毒素的脱毒研究一般是以AFB1的去除率为评价指标。

1.2 黄曲霉毒素B1

黄曲霉毒素B1分子式为C17H12O6,纯品为白色结晶,相对分子质量为312.06,裂解温度为268 ℃。AFB1结构中主要有3个毒性位点,见图2。其中,第一个毒性位点是呋喃环上的8、9位双键,该位点是黄曲霉毒素B1形成AFB1-pro、AFB1-DNA等复合体的作用位点,也是导致基因突变和致癌致畸的主要功能基团,这也是AFB1是黄曲霉毒素家族中毒性最强的原因;第二个毒性位点是10、11、15号位点,即AFB1中的香豆素的内酯环部分,这个位点容易发生化学水解,因而成为较为活跃的毒素降解位点;第三个位点是AFB1环戊烯酮环上的1、2、3、14号位点,该位点上的一些取代基团的存在与否也对AFB1的毒性有一定的影响[5]。

2 黄曲霉毒素的限量标准

WHO/FAO规定存在于食品和饲料中毒素的最大限量为(B1+B2+G1+G2)15 μg/kg,牛奶中AFM1的最大限量为0.5 μg/kg。1996年,美国FDA公布牛奶中AFM1的最大允许量为0.5 μg/kg,动物饲料中的最大允许量为300 μg/kg;食品中毒素的总量(B1+B2+G1+G2)不能超過20 μg/kg。2000年,欧盟制定了有关黄曲霉毒素的标准含量:直接食用的花生仁中AFB1的含量不得超过2 μg/kg,总量(B1、B2、G1、G2)小于4 μg/kg;而非直接食用花生仁中AFB1的含量不得超过8 μg/kg,总量小于10 μg/kg;奶制品中AFM1的含量不得超过0.05 μg/kg。这被称为国际上最为严格的限量标准。

中国卫生部在1982年颁布了AFB1在食品中的限量标准:花生仁、花生油、玉米中不得超过20 μg/kg;玉米及花生仁制品中含量小于20 μg/kg;大米和其他食用油中含量小于10 μg/kg;其他食品、豆类和发酵食品中含量小于5 μg/kg;婴儿乳制品不得检出。

3 黄曲霉毒素的生物脱毒方式

传统的黄曲霉毒素的脱毒方式有物理和化学方法。物理方法主要包括高温法、辐射法和物理吸附法。其中,采用高温法要加热至300 ℃才能使AFB1有明显的分解,显然成本太高;对于辐射法辐射除毒的研究比较多,沈祥震[6]、Youssef等[7]和迟蕾等[8]的研究表明辐照法去除真菌毒素效果明显,但辐照技术本身的放射性污染问题,辐射机理的认知不全,辐照对食物、饲料的安全性问题使辐射除毒技术的应用受到限制[6]。化学法主要包括碱处理法和氧化法,但化学法本身存在不稳定性,例如,在碱性条件下,AFB1的内酯环被打开,变成了香豆素钠盐或铵盐,黄曲霉毒素毒性消失,但从碱性恢复到中性时,打开的内酯环会重新连接成毒素[9]。再者,化学法安全性有待于评估,对产品的其他成分也有一定程度的破坏。因而其应用也受到限制。

生物脱毒方法可以分为以下两大类:微生物本身的吸附作用和微生物的代谢产物,例如酶或者抗氧化剂对毒素的降解作用。吸附作用和生物降解有本质区别,所以,两者的区分是研究微生物降解毒素的一个重要的基础工作[10]。

3.1 生物吸附法去除黄曲霉毒素

自然界部分微生物可通过非共价方式与黄曲霉毒素结合,形成菌体-黄曲霉毒素复合体,形成复合体的微生物自身吸附能力下降,复合体的状态稳定,很难被机体吸收,大部分排出体外,从而达到脱毒目的[11]。迄今为止,已经发现对黄曲霉毒素有结合吸附能力的微生物以乳酸菌(Lactobacilli)和酵母(Saccharomycetes)居多[12,13]。研究表明,乳酸菌和酵母菌对毒素的吸附能力与它们的细胞壁结构有关,它们主要通过细胞壁吸附毒素。原理是在乳酸菌和酵母的细胞壁上存在特殊的结合位点能结合不同的分子,例如金属离子和大分子的物质[12,13]。因而,死亡的细胞也和毒素有结合能力。研究表明,酵母细胞壁上的葡聚糖在吸附毒素上起重要作用,葡聚糖特有的螺旋状分子结构可以与多种毒素形成特异的互补结构[14]。与酵母细胞不同,乳酸菌对AFB1的结合能力有高度的种特异性,主要与细胞上的肽聚糖成分有关。这种以微弱的非共价键形式的结合是可逆的,反复的洗脱或者加入有机溶剂都能使毒素重新游离出来。而且菌株种类、处理方式、环境条件等都可以影响复合物的稳定性[12,15]。生物吸附和物理化學吸附一样,只是把毒素吸附在吸附剂的表面,让所检的样品中毒素含量下降。而且是一个可逆的过程,并不能从本质上脱去毒素的毒性。

3.2 生物降解法去除黄曲霉毒素

黄曲霉毒素的生物降解是指黄曲霉毒素分子的毒性基团被微生物产生的次级代谢产物或者所分泌的酶分解破坏,同时产生无毒或者低毒的降解产物的过程[16]。真菌、细菌、放线菌等均有报道对AFB1有不同程度的降解。

真菌对黄曲霉毒素降解作用的发现最早是20世纪70年代末,Detroy等[17,18]发现,树状指孢霉(Dactylium dendroide)能够降解AFB1环上的酮羰基。后来,Cole等[19]研究发现,少根根霉(Rhizopus arrhizus)可以将AFB1异构成其羟基化合物从而降低毒性。后来又相继发现寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)[20]、茎点霉(Phoma sp.)[21]、白腐菌(Trametes versicolor)[22]、假密环菌(Armillariella tabescens)[23]和黑曲霉(Aspergillus niger)[24]等均能产生降解黄曲霉毒素的物质,且一般是酶的作用。

对AFB1有降解作用的细菌主要包括:橙色黄杆菌(Flavobaterium aurantiacum)、分歧杆菌(Mycobacterium fluoranthenivorans)、红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)、芽孢杆菌(Bacillus sp.)、嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)、假单胞菌(Pseudomonas sp.)等。最早在1967年,Lillehoj等[25]首先发现橙色黄杆菌能够去除溶液中的黄曲霉毒素,经过Line等[26]和Smiley等[27]的相继研究,证实该菌对AFB1的降解机理可能是酶促作用。2004年,Hormisch等[28]通过以荧蒽为惟一碳源筛选到了一株分歧杆菌可以降解黄曲霉毒素,Teniola等[29]用分歧杆菌胞外提取物处理AFB1,证实解毒机理也为酶促反应,同时他还发现了红串红球菌也有降解AFB1的能力。近年来,又相继发现了芽孢杆菌[30]、嗜麦芽寡养单胞菌[31]、假单胞菌[32]等均有降解黄曲霉毒素的能力。

微生物降解AFB1时起作用的酶种类有多种。Michael等[33]证明了乳过氧化氢酶能降解AFB1,而且降解率与酶量有关。Motomura等[34]从白腐真菌(White-rot fungi)的糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)中分离纯化出了一种能降解AFB1的胞外酶,并通过荧光检测证实该酶断裂了AFB1的内酯环。Albert等[35]发现平菇对AFB1的降解能力与漆酶活性有一定的相关性,其研究表明将来源于白腐真菌的漆酶重组到了黑曲霉中,表达的重组漆酶(118 U/L)对AFB1的降解率达到55%,王会娟等[36]也筛选到了两株降解黄曲霉毒素的漆酶菌株。刘大岭等从假密环菌E-20中分离得到一种能降解AFB1的黄曲霉毒素解毒酶(ADTZ),其课题组后续研究发现该酶是一种氧化酶,将其改名为黄曲霉毒素氧化酶(AFO),并成功构建了重组酶rAFO在毕赤酵母中表达。该酶通过破坏AFB1的二呋喃环降解AFB1[37-41]。

4 生物降解产物

根据微生物或酶作用的毒性位点可以将产物大致分为3类。第一类产物是AFB1的毒性位点1发生降解形成,目前发现的第二类产物主要是AFB2a与AFB1-8,9-二氢二醇。Wang等[42]对白腐菌YK-624进行研究,发现此菌株所产生的锰过氧化物酶(MnP)可以高效去除AFB1。整个过程分为两个步骤,首先,在MnP存在下,将AFB1氧化为AFB1-8,9-环氧化物,接着再被水解为AFB1-8,9-二氢二醇,另外,在降解过程中,加入适量的吐温80有助于提高降解效率。刘大岭等[37]在研究假密环菌降解AFB1时,也发现AFB1被AFO首先氧化为环氧化物,接着水解为AFB1-8,9-二氢二醇,最后打开呋喃环。Yu等[43]研究发现在微生物降解AFB1的过程中,产生了一种发荧光的化合物AFB2a。AFB2a是AFB1的羟化产物,它有着与AFB1半缩醛完全一致的特性,于是又称AFB1-W[44]。据报道,AFB2a的毒性远远低于AFB1或AFB2,将1 200 μg AFB2a注入1日龄体重为50 g的鸭子,结果发现并没有产生与其他黄曲霉毒素相同的作用特征,AFB2a的毒性仅剩AFB1的1/200[45]。第二类产物是AFB1的毒性位点2降解形成。Lee等[46]发现AFB1毒性位点2的内酯环易被微生物降解变成荧光强度较低的AFD1,毒性也大大降低。第三类产物是AFB1的毒性位点3降解形成。Renate等[47]发现绿色木霉(Trichoderma viride)、不明毛霉(Mucor ambiguous)和黑曲霉将AFB1的毒性位点3上的2-环戊烯酮环上的酮羰基还原,形成黄曲霉毒醇(AFL),其毒性仅剩AFB1的1/18。AFB1生物降解的产物如图3。

5 小结与展望

生物降解法去除黄曲霉毒素具有安全、高效、环保、无毒无害等优点,是未来研究黄曲霉毒素防治的发展方向。现有不少关于生物降解黄曲霉毒素的研究,实现了对黄曲霉毒素不同程度的降解,且对降解机理及产物做了一定研究与报道,但对于黄曲霉毒素的完整代谢途径及相关降解酶的特性仍有待进一步深入研究和探讨。在未来的研究中,黄曲霉毒素的代谢机理和相关酶系特性的研究将会是该领域的发展方向之一。只有真正研究透彻黄曲霉毒素的降解过程,才能使生物降解过程更具有可控性;在此基础上通过将黄曲霉毒素降解酶在成熟模式生物中重组表达,以实现大规模工业生产,最终实现高纯度高活性的黄曲霉毒素降解酶的食品和饲料添加剂产品的开发。

参考文献:

[1] 陈 冉.花生中黄曲霉毒素降解技术研究[D].北京:中国农业科学院,2013.

[2] KURTZMAN C P,H0RN B W,HESSELTINE C W. Aspergillus nomius,a new aflatoxin producing species related to Aspergillus flavus and Aspergillus tamari[J].Antonie van Leeuwenhoek,1987, 53:147-158.

[3] 罗建伟,李荣涛,陈 兰,等.臭氧去除粮食中黄曲霉毒素B1的方法研究[J].粮食储藏,2003,32(4):29-33.

[4] 史莹华,许梓荣,冯建蕾,等.新型吸附剂AAN对黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的体外吸附研究[J].中国农业科学,2005,38(5):1069-1072.

[5] 李文明.黄曲霉毒B1的生物降解产物的分离鉴定及其致突变性研究[D].南昌:南昌大学,2013.

[6] 沈祥震.花生油中黃曲霉毒素B1紫外降解及安全性评价[D].山东泰安:山东农业大学,2014.

[7] YOUSSEF B M,MAHROUS S R,AZIZ N H. Effect of gamma irradiation on aflatoxin B1 production by Aspergillus flavus in ground beef stored at 5 ℃[J].Journal of Food Safety,1999,19:231-239.

[8] 迟 蕾,哈益明,王 锋.γ射线对赭曲霉毒素A的辐照降解与产物分析[J].食品科学,2010(11):320-324.

[9] 孙玲玉.枯草芽孢杆菌泰山株的分离鉴定及其对黄曲霉毒素的降解作用研究[D].山东泰安:山东农业大学,2014.

[10] 李超波,李文明,杨文华,等.降解黄曲霉毒素微生物筛选中降解与吸附结合作用的区分[J].食品与发酵工业,2012,38(5):17-21.

[11] 刘笛秋,邓建新,夏伟中,等.黄曲霉毒素对猪生产的影响及其生物防治研究进展[J].猪业科学,2014(11):86-87.

[12] HASKARD C,EI-NEZAME H,PELTONEN K,et al. Surface binding of aflatoxin B1 by lactic acid bacteria[J].Appl Environ Microbial,2001,67(7):3086-3091.

[13] BRADY D,STOLL A D,STRAKE L,et al. Chemical and enzymatic extraction of heavy metal binding polymera from isolated cell walls of Saccharomyces cerevisiae[J].Biotechnology and Bioengineering,1994,44(3):297-302.

[14] 杨乃欢,李 彪.新型霉菌毒素吸附剂——酵母细胞壁提取物[J].中国牧业通讯,2009(21):23-24.

[15] 张柏林,张若鸿,吴风亮,等.乳酸菌抗真菌活性及其抑制真菌毒素的效果[J].中国乳品工业,2005,33(6):31-37.

[16] 孙玲玉,柴同杰.黄曲霉毒素生物降解的研究进展[J].山东农业大学学报(自然科学版),2012,43(4):645-647.

[17] DETROY R W,HESSLTINE C W.Isolation and biological activity of a microbial conversion product of Aflatoxin B1[J]. Nature,1968,219(5157):967.

[18] DETROY R W,HESSLTINE C W.Aflatoxin:Instructure of a new transformation product of Aflatoxin B1[J].Canadian Journal of Biochemistry,1970,48(7):830-832.

[19] COLE R W,KIRKSEYJ W,BLANKENSHIP B R.Conversion of aflatoxin B1 to isomeric hydroxy compounds by Rhizopus spp.[J].Journal of Agriculture and Food Chemistry,1972,20(6):1100-1102.

[20] DOYLE M P,MARTH E H.Degradation of aflatoxin by lacytoperoxidase[J].Zeitschrift fur Lebensmittel——Untersuchung and Forschung,1978,166(5):271-273.

[21] SHANTHA T.Fungal degradation of aflatoxin B1[J].Natural Toxins,1999,7(5):175-178.

[22] ZJALIC S,REVERBERI M,RICELLI A,et al. Trametes versicolor:LA possible tool for aflatoxin control[J].International Journal of Food Microbiology,2006,107(3):243-249.

[23] 刘大岭,陈敏峰,姚东生.真菌提取液对黄曲霉毒素解毒作用的研究[J].广东药学院学报,1995,11(2):92-94.

[24] 李 冰,董征英,常维山.黑曲霉对黄曲霉毒素B1的降解与应用研究[J].飼料博览,2012(11):6-10.

[25] LILLEHOJ E B,CIEGLER A,HALL H H.Aflatoxin B1 uptake by Flavobaterium aurantiacum and resulting toxic effects[J].Journal of Bacteriology,1967,93(1):464-471.

[26] LINEJ E,BRACKETT R E,WILKINSON R E. Evidence for degradation of aflatoxin B1 by Flavobaterium aurantiacum[J]. Journal of Food Protection,1994,57(9):788-791.

[27] SMILEY R D, DRAUGHON F A. Preliminary evidence that degradation of aflatoxin B1 Flavobaterium aurantiacum is enzymatic[J].Journal of Food Protection,2000,63(l3):415-418.

[28] HORMISCH D,BROST I,KOHRING G W,et al. Mycobacterium fluoranthenivorans sp.nov.,a fluoranthene and aflatoxin B1 degrading bacterium from contaminated soil of a former coal gas plant[J].Systematic and Applied Microbiology,2004,27(6):653-660.

[29] TENIOLA O D,ADDO P A,BROST I M,et al. Degradation of aflatoxin B1 by cell-free extracts of Rhodococcus erythropolis and Mycobacterium fluoranthenivorans sp. nov. DSM44556T[J]. International Journal of Food Microbiology,2005,105(2):111-117.

[30] 王 燕,张美丽,毛 勇,等.黄曲霉毒素B1降解菌的分离鉴定及培养条件优化[J].河南农业科学,2015,44(4):139-143.

[31] LIANG Z H,LI J X,HE Y L,et al.AFB1 biodegradation by a new strain-Stenotrophomonas sp.[J].Agricultural Sciences in China,2008,7(12):1433-1437.

[32] Samuel M S,SIVAMAKROSHNAS A,MEHTA A,et al.Degradation and detoxification of a aflatoxin B1 by Pseudomonas putida[J].International Biodeterioration and Biodegradation,2014,86:202-209.

[33] MICHEAL P.DOYLE,ELMER H,et al. Degradation of aflatoxin by laetoperoxidase[J].Z.Lebensm.Unters.-Forsch,1978,166:271-273.

[34] MOTOMURA M,TOYOMASN T,MIZURO K,et al.Purificatioon and characterization of an aflation degration enzyme from Pleutus ostreatus.[J].Microbiological Research,2003,158(3):237-242.

[35] ALBERT J F,GELDERBLOM W C A,BOTHA A,et al. Degration of aflatoxin B1 by fungal laccase enzymes[J].International Journal of Food Microbiology,2009,135(1):47-52.

[36] 王会娟,刘 阳,邢福国,等.高产漆酶平菇的筛选及其在降解黄曲霉毒素中的应用[J].核农学报,2012,26(7):1025-1030.

[37] LIU D L,YAO D S,LIANG I L,et al. Detoxification of aflatoxin B1 by enzymes isolated from ArniiIlariella tabescans[J]. Food and Chemical Toxicology,1998,36:563-574.

[38] LIU D L,YAO D S,LI Y Q,et al. Production,purifiation,and characterization of an intracellular aflatoxin-detoxifizyme from Armillariella tabescens(E-20)[J].Food and Chemical Toxicology,2001,39:461-466.

[39] 胡丽莎.黄曲霉毒素氧化酶氧化作用机制的研究[D].广州:暨南大学,2011.

[40] CAO H,LIU D L,MO X M,et al. A fungal enzyme with the ability of aflatoxin B1 conversion:Purification and ESI-MS/MS identification[J].Microbiological Research,2011,166:475-483.

[41] 姚冬生,管 敏,赵 龙,等.产黄曲霉毒素解毒酶真菌(E-20)cDNA文库的构建[J].广东药学院学报,2004,20(1):45-48.

[42] WANG J Q,OGATE M,et al.Detoxification of aflatoxin B1 by manganese peroxidase from the white-rot fungus Phanerochaete sordida YK-624[J].FEMS.Microbiology Letters,2011,314(2):164-169.

[43] YU J.Genetics and biochemistry of mycotoxin synthesis.ARORA D K.Handbook of Fungal Biotechnology[M].New York:Marcel Dekker,2002.167-206.

[44] 羅胜军,谢光洪,李小兵,等.黄曲霉毒素B2a的研究进展[J].中国畜牧兽医,2006,33(11):96-98.

[45] TEUNISSON D J,ROBERTSON J A,BOUDREAUX G J. Isolation and structure of a biologically reduced aflatoxin B1[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,1970,18(6):1090-1091.

[46] LEE L S,DUNN J J,DELUCCA A J,et al. Role of lactone ring of aflatoxin B1 in toxicity and mutagenicity[J].Experientia,1981,37(1):16-17.

[47] RENATE M,REHM H J.Degradation products from aflatoxin B1 by Corynebacteriumrubrum,Aspergillus niger,Trichoderma viride and Mucor ambiguous[J].European Journal of Appllied Microbiology,1976,4:297-306.

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