菌落总数测试片环氧乙烷灭菌法研究

王艳蕊，肖茜文，刘 爽，刘 桐，何 苗，任大勇，陈 萍

（1.吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林长春 130118；2.吉林省安信食品技术服务有限责任公司，吉林长春 130012）

菌落总数测试片环氧乙烷灭菌法研究

王艳蕊1，肖茜文1，刘 爽1，刘 桐1，何 苗2，任大勇1，*陈 萍1

（1.吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林长春 130118；2.吉林省安信食品技术服务有限责任公司，吉林长春 130012）

考察环氧乙烷灭菌中灭菌温度、环氧乙烷质量浓度、灭菌时间、相对湿度对菌落总数测试片的灭菌效果，得出最佳灭菌参数。通过正交试验优化环氧乙烷灭菌工艺条件，采用生物检测法和化学检测法进行灭菌效果评价，以比色分析法检测菌落总数测试片中的环氧乙烷残留。结果表明，环氧乙烷对菌落总数测试片的最佳灭菌条件为灭菌温度55℃，环氧乙烷质量浓度600 mg/L，相对湿度40%，灭菌时间3 h，解析时间12 h，环氧乙烷残留量0.7 mg/kg；生物检测和化学检测合格；经过细菌增殖培养，与国标法培养结果符合率达到97%。由此可见，环氧乙烷能较好用于菌落总数测试片的灭菌，残留量符合规定，对灭菌物品性能无影响。

环氧乙烷灭菌；菌落总数测试片；比色分析

0 引言

菌落总数用来判定食品被细菌污染的程度及卫生质量，反映食品在生产过程中是否符合卫生要求，是食品卫生质量的重要指标之一[1]。菌落总数测试片法是一种将样液直接接种于测试片上，在一定温度下培养，对结果进行观察计数的新型检测技术，由于其具有省时省力、操作简单、便于运输、成本低等优点，已被广泛应用[2]。在工业化生产中，开展对菌落总数测试片的灭菌研究至关重要，环氧乙烷灭菌法作为一种可以在低温下灭菌的方法，是菌落总数测试片灭菌的首选。

环氧乙烷，又名氯化乙烯或氧丙烷，在常温常压下是无色气体，是一种广谱、高效、穿透力强、对消毒物品损害较小的灭菌剂，被广泛用于不耐热、不耐湿制品的灭菌中[3]。环氧乙烷灭菌效果受多种因素影响，为达到最佳灭菌效果，需要有效进行控制，以达到消毒灭菌的目的。试验从环氧乙烷灭菌温度、相对湿度、环氧乙烷质量浓度和灭菌时间等方面对菌落总数测试片灭菌效果的影响进行研究，建立可用于菌落总数测试片的灭菌方法，从而达到对测试片灭菌效果好、成本低的目的。

1 材料与方法

1.1 试验材料与方法

胰蛋白胨、酵母浸粉、琼脂粉等，北京兰博利德商贸有限公司提供；甘露醇、吐温-80、丙酮酸钠等，上海生物工程有限公司提供；自制菌落总数测试片；环氧乙烷化学指示卡、枯草杆菌黑色变种芽孢菌（Bacillus subtilisvar.niger） ATCC9372生物指示剂，北京四环卫生药械有限公司提供。

环氧乙烷灭菌器，山东新华医疗器械股份有限公司产品；超净工作台、DHP-781型电热恒温培养箱，上海新苗医疗器械制造有限公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 菌落总数测试片的制备

菌落总数测试片的制备详见陈萍等人[4]“一种菌落总数测试片、制备方法及其应用”。

1.2.2 环氧乙烷灭菌法

将待灭菌的菌落总数测试片试验包置于环氧乙烷灭菌器内，设置环氧乙烷质量浓度600 mg/L，相对湿度55%，灭菌温度55℃，灭菌3 h后，抽真空排除残余环氧乙烷，使其进入水中生成乙二醇排放，送入无菌空气，完全排除环氧乙烷[5]。

1.2.3 菌量计数方法

菌量计数方法参照《消毒技术规范》 （2002）将枯草杆菌黑色变种芽孢菌片放置于玻璃管内，将菌片打碎混匀，10倍梯度稀释，选择合适的稀释水平接种于培养基上，于37℃条件下培养24 h后计数。

1.2.4 灭菌效果评价

（1）生物监测法。生物检测采用环氧乙烷生物检测指示菌片（枯草杆菌黑色变种芽孢菌片）放于待灭菌包内，灭菌完成后立即取出生物指示菌片，制备菌悬液，进行细菌培养；由活菌计数法得到枯草杆菌黑色变种芽孢的残菌，以暴露时间为横坐标、枯草杆菌黑色变种芽孢残菌对数值为纵坐标，得到回归方程，计算得D值。试验重复3次，结果取平均值。D值是杀灭90%微生物所用的时间，等于线性曲线斜率的负倒数。

（2）化学检测法。采用环氧乙烷指示卡作为化学检测方法，将化学指示卡放在待灭菌包的中央，根据灭菌后化学指示卡的变色，判断是否已达灭菌效果。环氧乙烷指示卡由玫红色变为深紫色，灭菌完全。

1.2.5 环氧乙烷各因素灭菌条件的优化

（1）单因素试验。以D值为衡量指标，考察灭菌温度、环氧乙烷质量浓度、灭菌时间和相对湿度对环氧乙烷灭菌效果的影响。将标准试验包放入环氧乙烷灭菌器内，灭菌温度分别为45，50，55，60，65℃；环氧乙烷质量浓度分别为400，500，600，700， 800 mg/L；相对湿度分别为35%，45%，55%，65%，75%；灭菌时间分别为2.0，2.5，3.0，3.5，4.0 h。

（2）正交试验。在单因素试验的基础上，以D值作为试验的衡量指标，采用L9（34）正交试验设计，研究灭菌温度、环氧乙烷质量浓度、灭菌时间和相对湿度4个因素对D值的影响，确定最优灭菌参数。

正交因素与水平设计见表1。

表1 正交因素与水平设计

1.2.6 环氧乙烷残留量的检测

将已灭菌的菌落总数测试片在不同解析时间，参照李传秋等人[6]采用的比色分析法对灭菌后的菌落总数测试片进行取样和处理，测得灭菌后菌落总数测试片的环氧乙烷残留量。根据国家标准GB 8368—87中规定，物品经环氧乙烷灭菌解析后，其残留量应≤10 mg/kg。

1.2.7 环氧乙烷灭菌效果检测

使用环氧乙烷进行灭菌，检查生物检测和化学检测指标；在灭菌后的菌落总数测试片上接种一定浓度的混合菌悬液，计数红色菌落作为检测指标，同时与国标琼脂平板计数法进行对照，检测灭菌后环氧乙烷对菌落总数测试片细菌生长的影响。

1.3 统计分析

所有试验数据均采用SPSS和ORIGIN 9.0软件进行统计分析，各组数据均采用单因素ANOVA方差分析，结果用平均值±标准差（SD）表示。

2 结果与分析

2.1 灭菌温度对D值的影响

不同灭菌温度下的D值见图1。

图1 不同灭菌温度下的D值

由图1可知，随着灭菌温度的升高，D值在45～55℃时下降速度快；在灭菌温度大于55℃后，D值出现缓慢上升趋势，说明55℃以后随着灭菌温度的升高杀菌效果的增强幅度开始减小。由此可得出，灭菌温度为55℃左右较为适宜。

2.2 环氧乙烷质量浓度对D值的影响

不同环氧乙烷质量浓度下的D值见图2。

图2 不同环氧乙烷质量浓度下的D值

由图2可知，随着环氧乙烷质量浓度的升高，D值在400～600 mg/L时下降显著，在600 mg/L后下降趋势平缓，但没有出现平台期。由此可以得出，环氧乙烷质量浓度为600 mg/L时较为适宜。

2.3 灭菌时间对D值的影响

不同灭菌时间下的D值见图3。

图3 不同灭菌时间下的D值

由图3可知，随着灭菌时间的增加D值显著下降，灭菌时间大于3.0 h后，D值缓慢下降；继续增加灭菌时间，D值几乎不再变化。因此，选择3.0 h为菌落总数测试片的最佳灭菌时间。

2.4 相对湿度对D值的影响

不同相对湿度下的D值见图4。

图4 不同相对湿度下的D值

由图4可知，在相对湿度为30%～50%的范围内，D值缓慢下降；相对湿度为50%时，D值达到最小；在相对湿度为50%～70%的范围内，D值缓慢上升。因此，选择相对湿度为50%时进行环氧乙烷灭菌。

2.5 正交试验结果及最佳组合的确定

正交试验结果及极差分析见表2。

D值越小说明灭菌效果越好，极差越大表明该因素对D值的影响越大。从表2正交试验结果及极差分析表可知，环氧乙烷灭菌最优组合为A2B2C1D2，即灭菌温度55℃，环氧乙烷质量浓度600 mg/L，相对湿度40%，灭菌时间3 h，此时灭菌效果最好。因此，影响灭菌效果因素的主次顺序是灭菌温度＞环氧乙烷质量浓度＞相对湿度＞灭菌时间。

表2 正交试验结果及极差分析

2.6 灭菌后环氧乙烷残留量检测结果

试验结果表明，随着解析时间的增加，环氧乙烷残留量逐渐减少，解析12 h后，残留量0.7 mg/kg，符合灭菌后环氧乙烷残留量应小于10 mg/kg的规定。

菌落总数测试片环氧乙烷残留量检测结果见表3。

表3 菌落总数测试片环氧乙烷残留量检测结果

2.7 环氧乙烷灭菌效果检测结果

经过环氧乙烷灭菌后，环氧乙烷化学指示卡均由玫红色变为深紫色，灭菌完全；取出菌片适宜条件下培养，生物指示物培养结果均呈现阴性，灭菌合格。

与国标琼脂平板计数法进行比较，符合率达到97%，说明环氧乙烷灭菌后对菌落总数测试片细菌生长没有影响，灭菌解析后可以安全使用。

菌落总数测试片和国标法的细菌培养结果见表4。

表4 菌落总数测试片和国标法的细菌培养结果

3 讨论

环氧乙烷灭菌法是一种灭菌可靠、使用安全的低温条件灭菌法。灭菌后，对菌落总数测试片损害较小，灭菌效果可靠。

通过单因素试验和正交试验，不断完善和改进环氧乙烷对菌落总数测试片的灭菌条件，得出菌落总数测试片灭菌的最优组合。同时由结果得出，灭菌温度对环氧乙烷灭菌效果影响显著，灭菌效果随着灭菌温度的提升不断加强；其次是环氧乙烷浓度、相对湿度和灭菌时间，三者对灭菌效果的影响相对较小。采用比色分析法测定不同解析时间下环氧乙烷的残留，解析12 h后菌落总数测试片上的残留即可达到0.7 mg/kg，符合国标中环氧乙烷残留规定的限值要求；与国标琼脂平板计数法进行对比，细菌培养增殖结果符合率达到97%，说明环氧乙烷灭菌后对菌落总数测试片细菌生长没有影响，灭菌解析后可以安全使用。

国外对环氧乙烷灭菌研究较为成熟，国内却很少关于环氧乙烷灭菌方面的深入研究，试验对菌落总数测试片灭菌方式进行初步研究，为今后进一步研究菌落总数测试片的灭菌方法提供理论依据，具有一定的实用价值。

[1]王佳男，肖茜文，王艳蕊，等.食品微生物测试片研究进展 [J].食品安全质量检测学报，2016，7（2）：701-705.

[2]洪炳财，陈向标，赖明河.食品中微生物快速检测方法的研究进展 [J].中国食物与营养，2013，19（6）：15-18.

[3]徐燕，孙巍，吴晓松.环氧乙烷灭菌技术应用与发展[J].中国消毒学杂志，2013，30（2）：146-151.

[4]陈萍，王艳蕊，王佳男，等.一种菌落总数测试片、制备方法及其应用：中国，201610195209.7[P].2016.

[5]马伟，何静芳，沈伟，等.台式环氧乙烷灭菌器对医疗器械灭菌效果的试验观察 [J].中国消毒学杂志，2013，30（1）：25-27.

[6]李传秋，王磊，陈军.环氧乙烷灭菌效果及残留量的实验研究 [J].食品与药品，2014，16（1）：41-43.◇

Study on the Ethylene Oxide Sterilization of Aerobic Bacteria Counting Test Piece

WANG Yanrui1，XIAO Qianwen1，LIU Shuang1，LIU Tong1，HE Miao2，REN Dayong1，*CHEN Ping1

（1.School of Food Science and Engineering，Jilin Agricultural University，Changchun，Jilin 130118，China；2.Anxin Food Technology Services of Limited Liability Company in Jinlin Province，Changchun，Jilin 130012，China）

To obtained the optimal ethylene oxide sterilization parameter by comparing different sterilization effect of ethylene oxide with different temperature，concentration，sterilization time and relative humidity.Ethylene oxide sterilization process conditions are optimized by the orthogonal experiment，chemical and biological detection are used to evaluation the sterilization effect on the aerobic bacteria counting test piece，colorimetric analysis method in detecting the total number of colonies of ethylene oxide residues.The optimal sterilization condition is temperature 55℃，ethylene oxide concentration 600 mg/L，relative humidity 40%，sterilization time 3 h，after 12 h parsing，ethylene oxide residues is 0.7 mg/kg.The test of the biological and chemical are qualified；After bacterial multiplication culture，compared with national standard method the training results coincidence rate reaches 97%.Ethylene oxide sterilization can be better used to aerobic bacteria counting test piece sterilization，residues in accordance with regulations，and have no influence on performance of sterilization items.

ethylene oxide sterilization；aerobic bacteria counting test piece；colorimetric analysis

R181.2

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.01.008

1671-9646（2017）01a-0029-03

2016-11-25

吉林省科技发展计划资助项目（20150204018SF）。

王艳蕊（1989— ），女，硕士，研究方向为食品质量与安全。

*通讯作者：陈 萍（1968— ），女，博士，教授，研究方向为食品质量与安全。