四川某猪场仔猪腹泻病的病原学诊断

沈思思，汤 承，岳 华

（西南民族大学生命科学与技术学院，四川 成都 610041）

四川某猪场仔猪腹泻病的病原学诊断

沈思思，汤 承，岳 华*

（西南民族大学生命科学与技术学院，四川 成都 610041）

四川省双流区某商品猪场的5～10日龄仔猪暴发腹泻，且传播迅速，为查明病因，我们采集腹泻仔猪肛拭子15份，用RT-PCR分别检测猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪A群轮状病毒（GARV）、传染性胃肠炎病毒（TGEV）和猪Delta冠状病毒（PDCoV）。结果显示：样本的总阳性率为14/15，其中PEDV、GARV的阳性数分别为11、8，双阳性数为5，而TGEV和PDCoV未检出，说明该猪场仔猪腹泻由PEDV及GARV感染引起，且PEDV和GARV混合感染的情况较为严重。

猪流行性腹泻病毒；猪A群轮状病毒；混合感染

仔猪腹泻是集约化养猪生产条件下引起仔猪死亡的重要原因，致死率高，哺乳仔猪可达到100%[1]。主要的临床症状有精神萎靡、食欲不振、呕吐、腹泻、脱水等。引起仔猪腹泻的因素很多，其中猪流行性腹泻病毒（PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪冠状病毒（PDCoV）和猪A群轮状病毒（GARV）是4种常见病原[2-3]。四川双流区某商品猪场有150头5～10日龄仔猪于2015年10月暴发腹泻，临床表现为呕吐、腹泻并排出灰绿色水样稀粪，就诊时该猪场发病率为50%，死亡率为20%。本研究采用RT-PCR法分别对上述4种常见病原进行检测，结果报告如下：

1 材料

1.1 被检样本及试剂 腹泻仔猪肛门拭子15份；2× Taq PCR Master Mix购自擎科公司，DNA Marker II购自北京天根公司，RNAiso Plus、PrimeScriptTM等均购自宝生物工程（大连）股份有限公司，DEPC试剂购自Sigema公司。

1.2 参考毒株 TGEV、GARV、PEDV、PDCoV的cDNA均为西南民族大学动物医学实验室保存。

1.3 引物 PEDV、TGEV、PDCoV和GARV的引物序列由大连宝生物工程有限公司合成[4-5]，引物信息见表1。

表1 RT-PCR引物信息

2 方法

2.1 被检样本的处理 将15份腹泻样本（肛门拭子）用0.1mol/L PBS缓冲液稀释（按一个棉拭子加2mL PBS液的比例），涡旋混匀，12000r/min离心15min，取上清备用。

2.2 RNA提取和反转录

2.2.1 总RNA的提取 参考RNAiso Plus RNA提取说明书提取被检样本上清总RNA，沉淀用10μL DEPC水溶解。

2.2.2 cDNA的合成 参照反转录试剂盒说明书将总RNA反转录成cDNA，反转录采用20μL体系：5× buffer 4 μL，Random primer 2 μL，PrimeScript RTase 1μL，ddH2O 9μL，总RNA 4μL。反转录条件：37℃15min，85℃ 15s，16℃ 1min。

2.3 PCR扩增 用PEDV、GARV、TGEV、PDCoV的引物分别对15份被检样本的cDNA进行PCR扩增，同时以相应病原cDNA为阳性对照，无模板为阴性对照。反应体系为：cDNA 2.0μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，ddH2O 8.5 μL，总体积共25μL。PCR扩增条件为：95℃ 5min、95℃30s、55℃ 30s、72℃ 40s，共30次循环，72℃ 10min。取扩增产物5μL在1.5%琼脂糖凝胶板上点样，100V电压下电泳40min，凝胶成像系统上观察结果。随机抽取PEDV、GARV、TGEV、PDCoV检测阳性的PCR产物各2个送生物工程（上海）股份有限公司测序。

3 结果

15份被检样本的PCR扩增产物电泳结果见图1～图4。

由图可知，从11份被检样本中扩增出PEDV约680bp的条带，从8份样本中扩增出GARV约270 bp的条带。测序结果显示：序列是PEDV与GARV的特异序列，PEDV与Bank上所登录序列AF353511的同源性为99%，GARV与Bank上所登录序列JN104614的同源性为93%；PEDV和GARV双阳性样本数为5，混合感染率为33.3%；TGEV和PD CoV未检出。因此，确诊该猪场仔猪腹泻由PEDV及GARV感染所致，且PEDV和GARV混合感染情况较为严重。

图1 PEDV检测结果

图2 GARV检测结果

图3 TGEV检测结果

图4 PDCoV检测结果

4 讨论

曹恭貌等[6]对四川省9个地区的220份样本进行RT-PCR检测，结果显示：PEDV的检出率为41.54%，GARV的检出率为7.69%；胡兴义等[7]对贵州省5个地区的203份样本进行RT-PCR检测，结果显示：PEDV的检出率为63.54%，GARV的检出率为7.88%；刘云波等[8]对1 282份样本进行RT-PCR检测，结果显示：PEDV的检出率为24.49%，GARV的检出率为3.20%。GARV是导致仔猪腹泻的重要病原。王璐等[8]从121个猪场的531份病料中检出GARV阳性率为7.34%；王振玲等[9]从北京地区248份粪便样本中检出GARV的阳性率为17.7%。本研究RT-PCR检测结果显示：四川某猪场的仔猪腹泻是由PEDV和GARV感染引起的，PEDV的检出率为73.3%，GARV的检出率为53.3%，两者的混合感染率为33.3%。综上可以看出，PEDV是引起腹泻的主要原因，且轮状病毒检出率显著增高。TGEV和PDCoV也是引起仔猪腹泻的主要原因，但本研究中没有检出。总之，仔猪腹泻病因繁多，建议使用多重PCR对腹泻病原进行检测确诊，然后对症治疗。

[1]常洪涛，杜季梅，陈陆，等.新生仔猪急性腹泻疫情中5种病毒感染的分子检测[J].饲料工业，2013（11）：61-64.

[2] Li Z L，Zhu L，Ma J Y，et al.Molecular characterization and phylogenetic analysis of porcine epidemic diarrhea virus（PEDV）field strains in south China[J].Virus Genes，2012，45（1）：181-185.

[3] Zhu J，Yang Q，Cao L，et al.Development of porcine rotavirus vp6 protein based ELISA for differentiation of this virus and other viruses[J].Virology Journal，2013，10（1）：1-8.

[4]任玉鹏，陈弟诗，苏生禹，等.三种猪腹泻病毒性病原多重RT-PCR检测方法的建立及应用[J].中国兽医科学，2013，43（10）：1047-1051.

[5]任玉鹏，张斌，汤承，等.同时检测PEDV和TGEV及PDCoV的多重RT-PCR方法的建立及初步应用[J].中国兽医科学，2016，46（6）：756-762.

[6]曹恭貌，张斌，岳华，等.四川部分猪场PEDV、TGEV、GARV和PKV感染状况调查[J].动物医学进展，2016，37（1）：118-122.

[7]胡兴义，张双翔，金志强，等.贵州地区仔猪病毒性腹泻流行病学调查[J].中国预防兽医学报，2016，38（7）：542-545.

[8]刘云波，赵洪翠，王志成，等.猪病毒性腹泻分子流行病学调查[J].中国畜牧兽医，2013，40（2）：204-207.

Pathogen Diagnosis of Piglet Diarrhea in a Pig Farm in Sichuan Province

Shen Sisi，Tang Cheng，Yue Hua*
（College of Life Science and Technology，Southwest University for Nationalities，Sichuan Chengdu 610041，China）

There were many piglets of 5～10 days-old occuring diarrhea in a commercial pig farms in Shuangliu，Sichuan，and it spreaded rapidly.In order to find out the causes，15 diarrhea anal swab samples were collected，and pig epidemic diarrhea virus（PEDV），rotavirus（GARV），infectious gastroenteritis virus（TGEV），pig Delta coronavirus（PDCoV）were detected by RT-PCR methods.The results showed that the total positive rate of samples was 14/15，the positive number of PEDV and GARV were 11 and 8，double positive number was 5，TGEV and PDCoV were not checked out，which meaned that piglet diarrhea was mainly caused by mixed infection of PEDV and GARV，and it was very serious.

Porcine epidemic diarrhea virus（PEDV）；Group A rotavirus（GARV）；Mixed infection

S858.284.43

：B

：1001-8964（2017）02-0034-03

2016-11-28

沈思思（1991-），女，黑龙江齐齐哈尔人，硕士研究生，主要从事动物病原分子生物学研究。

*

：岳华，博士，教授。