一起犊牦牛腹泻病的病原学诊断

李 凡，阿 继，严 州，陈天祥，张 斌，汤 承*

（1.西南民族大学生命科学与技术学院，四川 成都 610041；2.四川省若尔盖县农业畜牧和水务局，四川 若尔盖 624500）

一起犊牦牛腹泻病的病原学诊断

李 凡1，阿 继2，严 州2，陈天祥2，张 斌1，汤 承1*

（1.西南民族大学生命科学与技术学院，四川 成都 610041；2.四川省若尔盖县农业畜牧和水务局，四川 若尔盖 624500）

四川省若尔盖县某养殖户的犊牦牛出现以腹泻为主要特征的疾病，传播迅速，发病率为100%，为弄清病因，我们采集了6份腹泻样本，分别用Trizol法和酚氯仿法提取腹泻粪便的总RNA和DNA，再用牦牛轮状病毒（RV）、牛冠状病毒（BcoV）、牛病毒性腹泻病毒（BVDV）、沙门氏菌（Salmonella）、产肠毒素大肠杆菌（ETEC）特异的PCR方法进行病原检测，结果得出这5种病原的检出数分别为6、0、6、0、5，可见该地区犊牦牛腹泻主要由RV、BVDV和ETEC混合感染引起。

牦牛腹泻；病原；牦牛轮状病毒；牛病毒性腹泻病毒

犊牦牛腹泻是指新生犊牦牛所发生的一种以腹泻为主要症状的消化道疾病，该病一年四季均可发生，尤其以初春及夏末秋初气候多变季节多发，病犊牛以精神沉郁，体温升高，腹胀、腹痛，废食，呼吸短促，粪便恶臭，间或混有血丝气泡，急性大量水泻，脱水，自体中毒及心力衰竭为主要临床特征，是造成犊牛死亡、生长发育不良最严重的疾病之一，给养牛业造成了巨大的经济损失[1]。

当前引起犊牛腹泻的原因极其复杂，包括感染性因素（病毒、细菌和寄生虫）和非感染性因素（营养因素和环境因素）[2-3]。其中，病原微生物感染是造成犊牛腹泻的重要原因,常见的引起犊牛腹泻的病原主要有RV、BcoV、BVDV、Salmonella以及ETEC等[4-5]，其临床症状及病理剖检很相似，需要通过实验室检测才能确诊。本试验对2016年采自若尔盖县某牦牛养殖户的6份腹泻样本进行了RV、BCoV、BVDV、Salmonella和ETEC的PCR检测，以确诊到底是何种病原引起的腹泻，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 被检样本及试剂 6份无菌采集的犊牦牛腹泻粪便样本，2016年8月采于若尔盖县某养殖户的3月龄发病犊牦牛，临床表现为腹泻，排出灰白色、深绿色粪便和血便，脱水。

试剂：2×Taq PCR Master Mix（擎科公司），DNA Marker II、Marker DL2000（北京天根公司），RNAiso Plus、PrimeScriptTM等均购自宝生物工程（大连）股份有限公司；DEPC试剂购自Sigema生物公司。

1.2 参考毒株 牦牛RV分离株、BCoV阳性样本、BVDV分离株、沙门氏菌分离株及ETEC分离株均为西南民族大学动物医学实验室保存。

1.3 引物 牦牛RV、BVDV和Ecoli.K99的检测引物均参照文献，由大连宝生物工程有限公司合成，引物信息见表1。

表1 RT-PCR引物信息

1.4 方法

1.4.1 被检样本处理与核酸提取 将6份腹泻样本用0.1mol/L PBS缓冲液按1∶3（m/v）比例稀释，涡旋混匀，-80℃冰箱中反复冻融3次，以12000r/min离心15min，取上清，然后按照Trizol Reagent说明书提取总RNA，并按照反转录试剂盒说明书合成cDNA。反应体系为：5×buffer 4μL，Random primer 2μL，PrimeScript RTase 1 μL，ddH2O 9 μL；反转录条件为：37℃ 15 min，85℃ 15 s，16℃ 1min，-20℃保存备用。DNA的提取采用酚氯仿法。

1.4.2 PCR扩增 用 RV、BCoV、BVDV、Salmonella和ETEC的引物对67份样本的cDNA和DNA模板进行PCR扩增。反应体系为：cDNA 2.0 μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5μL，上、下游引物各1.0 μL，ddH2O 8.5μL，总体积共25μL。PCR扩增条件为：95℃5min，95℃ 30s，52℃ 45s，72℃ 45s，72℃ 10 min。取扩增产物5μL在2%琼脂糖凝胶板上点样，100V电压下电泳40min，于凝胶成像系统中观察结果。将RV、BCoV、BVDV、Salmonella和ETEC检测呈阳性的PCR产物送至生物工程（上海）股份有限公司测序。

2 结果

2.1 被检样本的RT-PCR检测结果 电泳结果显示：在PCR扩增产物电泳中分别扩增出约231bp、230 bp、498 bp的条带，分别为牦牛RV、BVDV和Ecoli.K99的特异条带，BCoV与Salmonella仅有阳性对照扩增出条带，结果见图1～图5。将扩增出的阳性产物送至生物工程（上海）股份有限公司测序，结果显示：牦牛RV与NCBI上所登录序列的同源性为100%，BVDV同源性为90.6%，Ecoli.同源性为98%。

图1 牦牛RV扩增结果

图2 牦牛BCoV扩增结果

图3 牦牛BVDV扩增结果

图4 牦牛Salmonella扩增结果

图5 牦牛ETEC扩增结果

2.2 阳性检出率及混合感染情况 6份临床腹泻样本中，牦牛RV的阳性检出率为100%（6/6），BCoV的阳性检出率为 0，BVDV的阳性检出率为 100%（6/6），Salmonella的阳性检出率为0，ETEC的阳性检出率为83.3%（5/6）。混合感染率为83.3%。

3 小结与讨论

实验室检测结果结合临床症状分析，本次若尔盖县养殖户的犊牦牛腹泻病呈混合感染，主要是由牦牛RV、BVDV和ETEC混合感染所致。

2016年周芳等[6]在青藏高原地区进行了BRV病原流行病学调查，发现BRV在云南、青海、四川和西藏的腹泻样本的感染率分别为90%、95%、85.19%和60%，证明BRV是引起牦牛腹泻的重要病原。2016年陈新诺等[11]对青藏高原地区四个省的牦牛腹泻样本进行了BVDV病原流行病学调查，发现BVDV感染在青藏高原地区的牦牛中普遍存在。达娃次仁等[12]从西藏地区的240份牦牛腹泻病料中分离到200株牦牛源大肠杆菌。郝一妹等[13]对26份牦牛腹泻粪便样本和部分健康粪便样本进行产肠毒素大肠杆菌（ETEC）的分离和检测，结果表明产肠毒素大肠杆菌在牦牛腹泻样本中的检出率显著高于外表健康的牦牛，说明产肠毒素大肠杆菌在牦牛粪便中广泛存在。

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Pathogen Diagnosis of a Case of Yak Diarrhea

Li Fan1，A Ji2，Yan Zhou2，et al.
（1.College of Life Science and Technology，Southwest University for Nationalities，Sichuan Chengdu 610041；2.Agriculture and Animal Husbandry and Water Authority of Ruoergai County，Sichuan Ruoergai 624500，China）

There were some prominent feature of the diseases with diarrhea in yak of some farmers at Ruoergai area，Sichuan province，which spreaded rapidly and its incidence rate was 100%.In order to find out the causes，6 diarrhea samples were collected，Trizol regent kit and phenol-chloroform extraction methods were used to extract total RNA and DNA of diarrhea feces，then yak rotavirus（RV），bovine coronavirus（BcoV），bovine viral diarrhea virus（BVDV），Salmonella，enterotoxigenic escherichiacoli（ETEC）were detected by specific PCR methods.The results showed that the amount of the five kinds of pathogens were 6，0，6，0，5，which meaned that yak diarrhea was mainly caused by mixed infection of yak RV，BVDV and ETEC.

Yak diarrhea；Pathogen；Yak rotavirus；Bovine viral diarrhea virus

S858.234.43

：B

：1001-8964（2017）02-0029-03

2016-11-29

“十三五”国家重点研发计划（2016YFD0500907）

李凡（1992-），女（壮族），云南文山人，研究生，主要从事动物病原分子生物学研究。

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：汤承，博士，教授。