熊去氧胆酸生产中相关物质的分析

谢 强, 王 坤, 陶家林

(1. 四川大学 生物治疗国家重点实验室,四川 成都 610041；2. 中国科学院 成都有机化学有限公司，四川 成都 610041)

·研究简报·

熊去氧胆酸生产中相关物质的分析

谢 强1,2, 王 坤2, 陶家林2

(1. 四川大学 生物治疗国家重点实验室,四川 成都 610041；2. 中国科学院 成都有机化学有限公司，四川 成都 610041)

建立了HPLC-示差折光检测器外标法测定熊去氧胆酸中4种特殊杂质及其他有关物质含量的方法，结果表明各样品在测定范围内线性关系良好(r=0.999 1～0.999 6)，方法回收率、精密度、稳定性、重复性均符合要求，适用于熊去氧胆酸生产的质量控制。

熊去氧胆酸; 鹅去氧胆酸; 7-酮基石胆酸; 高效液相法; 示差检测器; 分析

熊去氧胆酸(UDCA)是名贵中药熊胆的主要有效成分，主要用于胆结石、原发性硬化性胆管炎、病毒性肝炎等多种胆汁淤积性肝病的治疗，是美国FDA批准治疗原发性胆汁性肝硬化(PBC)的唯一药物[1-3]。该药物同时也是唯一用于肝脏移植术中提高手术成活率的药物，属于消化内科重要的临床治疗药物。

目前熊去氧胆酸的制备主要采用鹅去氧胆酸(CDCA)化学合成，在生产和贮存过程中主要有以下杂质：7-酮基胆石酸(7K-LCA)、胆酸(CA)和胆石酸(LCA)(Chart 1)[4-5]。研究结果表明杂质成分如胆石酸可能引起一些不良反应[6]。因此对熊去氧胆酸的质量控制在安全用药上显得尤为重要。当前关于熊去氧胆酸的分析,主要有TLC法、气相色谱法和HPLC法。《中国药典》2015年版中采用酸碱滴定法测定熊去氧胆酸含量，对有关物质采用薄层色谱法检测，专属性和灵敏度有一定局限性[7-9]。相关文献中采用HPLC-UV法，但熊去氧胆酸等胆酸类组分紫外吸收较弱，最大吸收波长均处于末端吸收[10-11]。

Chart 1

为了有效检出熊去氧胆酸中的相关杂质，更好地控制其质量，本文建立了熊去氧胆酸有关物质检测的HPLC-RID法，能同时测定熊去氧胆酸中4种特殊杂质及其他有关物质含量，该法具有简便、快速、准确等优点，适用于熊去氧胆酸的质量控制。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

日本岛津LC-20AD型高相液相色谱仪；岛津RID-20A型示差检测器；Anlais3010型工作站。

胆酸(98%)和胆石酸(98%)，麦卡希试剂；7-酮基石胆酸(98.5%)，自制；鹅去氧胆酸、熊去氧胆酸对照品由中国药品生物制品检定所提供；熊去氧胆酸样品由中国科学院成都有机化学有限公司大邑分公司提供，批号：UD-151224、151226、151230；水为超纯水，甲醇、乙腈为色谱纯，磷酸氢二钠和磷酸为分析纯。

1.2 分析方法

(1) 色谱条件

色谱柱:Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm， 5 μm)，流动相:0.02 mol·L-1磷酸氢二钠溶液(用磷酸调节pH=3.0)/甲醇/乙腈(30/40/30)，流速：1 mL·min-1，柱温40 ℃，进样量20 uL。按外标法计算供试品中已知杂质含量，以熊去氧胆酸的峰面积计算其他未知杂质含量。

(2) 溶液配制

对照品溶液的配制：精密称取熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸、胆酸、7-酮基石胆酸、胆石酸对照品，用甲醇溶解，用流动相配成含熊去氧胆酸4 mg·mL-1、鹅去氧胆酸2 mg·mL-1、胆酸1 mg·mL-1、7-酮基石胆酸1 mg·mL-1、胆石酸0.5 mg·mL-1的溶液，作为对照品贮备液。精密量取贮备液各1 mL，用流动相定容至10 mL，作为对照品溶液。

样品溶液的配制：取样品适量，用甲醇溶解，用流动相稀释为40 mg·mL-1。

2 结果与讨论

2.1 系统适用性

取对照品溶液，按上述色谱条件进样，记录色谱图(图2)，系统适用性结果见表1。从表1可以看出，各样品的分离度均1.5，符合药典基线分离要求，且极性最弱的胆石酸出峰时间较快，总分析时间不超过15 min，系统适用性好。

Time/min图2 对照品的高效液相色谱图Figure 2 HPLC chromatogram of standard表1 系统适用性结果Table 1 Results of system suitability

组分保留时间理论塔板数分离度熊去氧胆酸5.6006396胆酸6.52577543.2187-酮基胆石酸7.07082161.796鹅去氧胆酸8.62279704.456胆石酸12.85786689.047

2.2 线性范围和检测线

分别精密量取对照品贮备液，分别用甲醇溶解制成一系列浓度标准溶液(熊去氧胆酸：0.1, 0.3, 0.6, 1.0, 2.0 mg·mL-1；胆酸： 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05 mg·mL-1；7-酮基胆石酸：0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05 mg·mL-1)；鹅去氧胆酸：0.05, 0.10, 0.20, 0.40, 0.80 mg·mL-1；胆石酸：0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05 mg·mL-1，按质量浓度由低到高分别进样20 μL，记录峰面积以浓度x(mg·mL-1)对峰面积y作标准曲线，回归得到线性方程，结果见表2。由表2可见，各组分在测定范围内线性关系良好，符合定量要求。

表2 熊去氧胆酸及相关杂质的回归方程和检测范围Table 2 Linear functions and detection limits of ursodeoxycholic acid and its related substances

2.3 精密度

在上述色谱条件下，取各组分对照品溶液20 uL，重复进样5次进行测试。熊去氧胆酸 、7-酮基胆石酸、鹅去氧胆酸、胆酸及胆石酸峰面积RSD分别为0.32%， 1.31%， 0.76%， 1.15 %， 1.05%(n=5)，说明系统稳定性良好。

2.4 重复性

精密称取熊去氧胆酸样品(UDCA-151224) 5份,按“1.2.2”项下方法制备供试品溶液,5次重复测定结果见表3。由表3可看出该方法重复性良好。

表3 重复性试验结果Table 3 Results of repeated tests

2.5 稳定性

精密吸取供试品溶液,在0, 2, 4, 6, 8 h 按色谱条件进样测定,峰面积 RSD分别为1.6%, 1.1%, 1.2%和1.3%,表明8 h内样品各成分稳定性良好。

2.6 有关物质测定

对3批样品(UD-151224、UD-151226、UD-151230)分别进行测定，结果见表4。由表4可以看出，这三批样品中均未检出胆酸和胆石酸，主要杂质为鹅去氧胆酸和7-酮基胆石酸，其他未知杂质含量均小于2.5‰，符合欧洲药典EP6.0要求，其中UD-151230的最大单个杂质小于0.1‰，符合欧洲药典EP7.0要求。

表4 熊去氧胆酸中各有关物质的测定结果(%)*Table 4 The detection results of related substances(%)

*-表示未检出；a其他最大单个杂质

参照《中华人民共和国药典》(二部)中记载的方法及相关文献，建立了一种能同时测定熊去氧胆酸中主要成分熊去氧胆酸以及主要杂质鹅去氧胆酸、7-酮基石胆酸、胆酸和胆石酸的含量的HPLC-RID方法。方法回收率、精密度、稳定性、重复性均符合要求，适用于熊去氧胆酸生产的质量控制。

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Analysis of Related Substances in The Production of Ursodeoxycholic Acid

XIE Qiang1,2, WANG Kun2, TAO Jia-lin2*

(1. State Key Laboratory of Biotechnology, Sichuan University， Chengdu 610041, China 2. Chengdu Organic Chemicals Co., LTD., Chinese Academy of Sciences， Chengdu 610041, China)

A HPLC-refractive index detector method for determination of four special substances and other substances in the production of Ursodeoxycholic acid was established. Determination of the impurity possesses good linearity(r=0.999 1～0.999 6), and the method of recovery, precision, stability and repeatability meet standards. The method is suitable for the quality control of Ursodeoxycholic acid production.

Ursodeoxycholic acid; Chenodeoxycholic acid; 7-ketolithocholic acid; high performance liquid chromatography; refractive index detector; analysis

2016-11-01

谢强(1986-)，男,汉族，四川彭州人，助理研究员，主要从事胆酸类化合物的提取分离及结构改造等研究。E-mail:vvxq@hotmail.com

陶家林，研究员， Tel. 028-85217603, E-mail： jialint@cioc.ac.cn

O657.7; O629.22

A

10.15952/j.cnki.cjsc.1005-1511.2017.02.16279