灰树花多糖对人肺腺癌细胞株A549线粒体的影响

2017-02-28 03:01倪艳波张立霞崔大鹏张妍霞
中国老年学杂志 2017年3期
关键词:膜电位树花线粒体

倪艳波 张立霞 崔大鹏 张妍霞 赵 敏 杨 静 李 琳

(滨州医学院,山东 烟台 264003)

灰树花多糖对人肺腺癌细胞株A549线粒体的影响

倪艳波 张立霞 崔大鹏 张妍霞 赵 敏 杨 静 李 琳

(滨州医学院,山东 烟台 264003)

目的 检测人肺癌细胞株A549的细胞增殖、线粒体呼吸水平及线粒体膜电位,观察灰树花多糖对A549线粒体的影响。方法 CCK-8法检测A549细胞增殖,线粒体呼吸系统检测细胞线粒体呼吸水平,MitoTracker Red CMXRosb线粒体荧光探针、罗丹明123(Rh123)检测线粒体膜电位。结果 CCK-8检测细胞增殖显示0.4%的灰树花多糖即可抑制A549细胞的增殖,0.6%灰树花多糖作用4 h 后,绝大多数A549细胞死亡,其结果与对照组相比较有显著差异(P<0.05);线粒体呼吸系统结果显示,0.4%灰树花多糖作用于A549细胞4 h 后细胞呼吸微弱;荧光显微镜观察细胞状态、线粒体荧光探针染色显示,0.4%、0.6%灰树花多糖组部分细胞凋亡,细胞收缩呈圆形,强荧光表达;流式细胞仪检测线粒体膜电位显示,0.4%、0.6%灰树花多糖组荧光信号增强。结论 灰树花多糖可以抑制A549的增殖,其作用机制与线粒体膜电位的耗散相关。

灰树花多糖;A549;线粒体

A549细胞系是人肺腺癌细胞系,是研究肺癌与肺纤维化的常用细胞系,以转化生长因子(TGF)-β1诱导A549细胞出现上皮细胞-间质细胞转化是肺纤维化体外研究的常用方法〔1,2〕。本研究观察灰树花多糖对A549细胞转化的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞、药品及仪器 肺腺癌细胞株A549,购自中科院上海细胞库。灰树花多糖,浙江方格药业有限公司,纯度50%;线粒体荧光探针,MitoTracker Red CMXRosb,美国Invitrogen公司;罗丹明123(Rh123),南京凯基生物科技有限公司;凯基新型四唑单钠盐法检测试剂盒,南京凯基生物科技有限公司。IX71倒置荧光显微镜,奥林巴斯株式会社;流式细胞仪,贝克曼库尔特XL;全波段酶标仪,美国Molecular Devices;线粒体呼吸系统Oxygraph-2k,奥地利Oroboros。

1.2 实验方法

1.2.1 灰树花多糖溶液配制 将1 g灰树花多糖加至50 ml生理盐水中,用300目滤网过滤一遍,高压消毒备用。

1.2.2 实验分组 0.2%,0.4%,0.6%灰树花多糖组:分别将10、20、30 μl配制好的灰树花多糖溶液加入完全培养基(高糖DMEM+10%胎牛血清)至100 μl。以完全培养基正常培养组为对照组。

1.2.3 细胞增殖检测 将100 μl A549细胞加入96孔板中,培养24 h后至倒置显微镜上观察细胞状态,将原培养基吸出,各组分别加入10、20、30 μl灰树花多糖溶液及完全培养基,放回CO2培养箱中培养4 h,向每孔加入10 μl CCK-8试剂,孵育4 h,至全波段酶标仪测定在450 nm处的吸光度。

1.2.4 线粒体呼吸系统检测 A549细胞接种至培养瓶中,培养细胞至85%铺满培养瓶底,以0.4%的浓度加灰树花多糖作用4 h,以完全培养基为对照组,收取细胞,离心,PBS洗一次,两组分别取200 μl细胞加入已经平衡好的线粒体呼吸系统检测A、B池内,检测细胞线粒体呼吸水平。

1.2.5 MitoTracker Red CMXRosb检测 将100 μl A549细胞爬片,培养24 h后,以0.2%,0.4%,0.6%的浓度加灰树花多糖,完全培养基作对照,放回CO2培养箱中培养4 h,向每孔加入MitoTracker Red CMXRosb 10 μl,孵育30 min后至倒置荧光显微镜下观察。

1.2.6 流式细胞仪检测线粒体膜电位 A549细胞种至6孔板中,培养细胞至近80%铺满培养板底,以0.2%、0.4%、0.6%灰树花多糖的浓度加灰树花多糖,完全培养基作对照,加入Rh123(5 μg/ml,1 ml)孵育10 min,胰酶消化,收集细胞,离心去上清,加PBS冲洗一遍,流式细胞仪上机检测。

1.3 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件进行析因分析。

2 结 果

2.1 A549细胞增殖情况 与对照组(1.12±0.33)相比较,0.2%灰树花多糖组细胞增殖(0.98±0.306)差异无统计学意义(P>0.05),0.4%灰树花多糖组细胞增殖(0.816±0.16)差异显著(0.01

2.2 A549细胞线粒体呼吸水平 线粒体呼吸系统显示,0.4%灰树花多糖组氧耗量平均值为48.07 pmol·s-1·ml-1,明显低于对照组氧耗量(63.5 pmol·s-1·ml-1)。

2.3 A549细胞生长状态线粒体荧光探针染色观察 加不同浓度的灰树花多糖培养4 h后至倒置显微镜下观察发现,0.2%灰树花多糖组与对照组细胞状态好,形状无改变;0.4%灰树花多糖组细胞量较对照组少,大多数细胞形状无改变,部分细胞凋亡,凋亡细胞形状收缩呈圆形;0.6%灰树花多糖组大多数细胞凋亡或死亡,贴壁细胞数少,极少数细胞保持A549细胞的原有形状。倒置荧光显微镜下观察可以发现正常细胞荧光染色均匀,可见清晰的细胞核,凋亡细胞小,呈圆形,荧光强度较正常细胞强,未见细胞核。见图1。

图1 细胞培养状态与线粒体荧光探针染色(×100)

2.4 流式细胞仪检测A549细胞膜电位 Rh123染色,流式细胞仪检测,对照组与0.2%灰树花多糖组荧光信号强度几乎相同,0.4%灰树花多糖组荧光信号强度稍强,0.6%灰树花多糖组荧光信号强度较其他组强、流式峰图明显右移。见图2。

图2 Rh123染色检测线粒体膜电位(Overlay)

3 讨 论

灰树花又名贝叶多孔菌、千佛菌、栗子蘑、云蕈等,其营养丰富,含有生物活性物质,具有独特的营养和药用价值。灰树花含有还原糖、甘露糖、葡聚糖,以葡聚糖为主〔3〕。实验研究表明,从灰树花子实体提取的多糖具有抗肿瘤作用,并有一定预防肿瘤的效果,目前对于抗肿瘤的研究主要集中在卵巢癌、乳腺癌等〔4~6〕,对于肺癌的研究相对较少。本研究用CCK-8法研究灰树花多糖对人肺腺癌细胞A549细胞增殖的影响,发现较大剂量的灰树花多糖可以抑制A549细胞的增殖,甚至造成A549细胞的大量凋亡及死亡。CCK-8法检测细胞增殖是一种较以前常用研究细胞增殖的方法MTT操作简便,稳定性、重复性更高的检测方法〔7〕。线粒体呼吸系统又称高分辨呼吸测定系统,可以对培养细胞、人体组织等进行呼吸测定。本研究0.4%灰树花多糖组与对照组取相同的细胞量进行呼吸测定,发现0.4%灰树花多糖组耗氧量低,该组细胞呼吸微弱。细胞或组织呼吸微弱可能是由细胞凋亡,线粒体或新陈代谢疾病,过氧应激等病理现象导致,结合其他实验结果,考虑细胞呼吸水平的减弱与灰树花多糖促进A549细胞的细胞凋亡相关,细胞凋亡与线粒体膜电位的耗散具有密切的相关性。MitoTrackers Red选择性聚集在线粒体,与线粒体内的蛋白质生成稳定的生物共轭体,实现对线粒体的稳定的荧光染色,其积累取决于膜电位,是常用的线粒体检测染料之一〔8〕。Rh123是一种可透过细胞膜的阳离子荧光染料,是一种线粒体跨膜电位的指示剂〔9〕。本研究提示灰树花多糖会影响A549细胞的体外增殖,其作用与线粒体膜电位的耗散相关。

1 黄珍姐,郑金旭,汤 艳,等.肺泡上皮细胞间质转化及其信号转导途径在肺纤维化中的作用〔J〕.临床肺科杂志,2011;16(6):823-6.

2 黄 敏,杨惠芳,陈 楠,等.百草枯诱导A549细胞间质转化及四氢吡咯二硫化氨基甲酸酯的干预作用〔J〕.工业卫生与职业病,2013;39(6):321-7.

3 李 磊,王卫国,郭彦亮,等.灰树花多糖的制备与其生物活性研究进展〔J〕.食品工业科技,2009;30(11):327-31.

4 Soares R,Meireles M,Rocha A,etal.Maitake(D fraction) mushroom extract induces apoptosis in breast cancer cells by BAK-1 gene activation〔J〕.J Med Food,2011;14(6):563-72.

5 Jiang J,Sliva D.Novel medicinal mushroom blend suppresses growth and invasiveness of human breast cancer cells〔J〕.Int J Oncol,2010;37(6):1529-36.

6 Martin KR,Brophy SK.Commonly consumed and specialty dietary mushroomsreduce cellular proliferation in MCF-7 human breast cancer cells〔J〕.Exp Biol Med(Maywood),2010;235(11):1306-14.

7 熊建文,肖 化,张镇西.MTT 法和CCK-8法检测细胞活性之测试条件比较〔J〕.激光生物学报,2007;16(5):559-62.

8 葛杨杨,谷 庆,马长生,等.MLN2238对宫颈癌HeLa细胞生长抑制和放射增敏及其机制探讨〔J〕.中华肿瘤防治杂志,2014;21(4):246-51.

9 Blattner JR,He L,Lemasters JJ.Screening assays for the mitochondrial permeability transition using a fluorescence multiwell plate reader〔J〕.Anal Biochem,2001;295(2):220-6.

〔2015-09-01修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

山东省自然科学基金项目(ZR2013HL002);烟台市科技发展计划项目(2012129);滨州医学院科技重点计划(BY2013KJZD04,BY2012KJZD10)

张立霞(1981-),女,硕士,高级实验师,主要从事食用菌多糖实验研究。

倪艳波(1979-),男,硕士,讲师,主要从事灰树花多糖药理作用研究。

R965.1

A

1005-9202(2017)03-0542-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.03.009

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