超高压液相色谱串联高分辨质谱筛查渔用投入品中禁限用药物

孔聪　周哲　汪洋　黄原飞　沈晓盛　黄冬梅　蔡友琼　于慧娟

摘要建立了超高压液相色谱静电场轨道离子阱质谱系统对渔用投入品中可能造成风险隐患的禁限用药物的快速篩查与定量技术。以水（含1%甲酸）乙腈（1∶9， V/V）溶液进行提取，通过稀释降低基质效应，在Accucore RPMS 色谱柱（100 mm × 2.1 mm， 2.6 μm）上，以水（含0.1%甲酸）和乙腈（含0.1%甲酸）溶液为流动相，利用梯度洗脱、ESI离子化，Fullscan ddMS2 （opN）扫描模式进行数据采集，通过与预先建立好的药物标准品质谱、色谱数据库进行比对分析，实现了53种禁限用药同时筛查确证与定量分析。各药物最低检出浓度均低于10 ng/mL，在0.01～1.0 μg/mL范围内，各药物的线性相关系数均大于0.98，根据实际测定结果设定对渔药及渔用饲料中筛查药物的检出限分别为0.5和5.0 mg/L，对渔药及渔用饲料基质添加10和100 mg/kg 的各筛查成分，定量回收率均高于50%，相对标准偏差均小于15%。将本方法用于农业部渔用投入品质量安全隐患排查项目中，共筛查68个样品，其中在29个渔用兽药样品中筛查出15种说明书中未标明成分。

关键词渔用投入品； 筛查； 高分辨质谱

1引 言

我国水产养殖产量占全世界总量70%左右，是渔用投入品（包括渔药与渔用饲料）生产与消费大国[1]。渔用投入品中添加违禁药物将导致水体污染、水产品违禁药物残留，并通过食物链富集转移到人体中，危害人体健康[2]。在我国，存在渔用投入品中添加禁用或限用药物的不规范生产和使用现象，导致其在水产品中残留超标，影响我国养殖水产品质量安全，有必要对渔用投入品中禁限用药物进行检测，以确保投入品的安全使用[3]。

目前，渔用投入品中禁限用药物的检测主要采用液相色谱法[4]、液相色谱串联质谱法[5]、气相色谱串联质谱法[6]、酶联免疫吸附分析法[7]等。液相色谱三重四极杆质谱联用技术具有检出限低、准确度高和重现性好等特点，在渔用投入品检测中应用最为普遍[8]。但由于渔用投入品理化性质差别较大，且三重四极杆质谱仪质量精密度较低，单次检测较多种类的化合物相互干扰较大，通常以结构类似的同族药物或单一药物来开发相应的方法[9]，在药物筛查中需建立多种检测方法，且对非检项目的筛查能力不足，造成检测资源浪费， 通过高效的多组分同时筛查和定性技术可解决该问题[10，11]。

基于静电场轨道离子阱的超高分辨率质谱技术为多组分目标化合物分析提供了新的研究方向[12]。静电场轨道离子阱质谱系统与色谱分离技术串联，可在一次检测过程中对数百种化合物进行分析[13]。该质谱可进行基于母离子强度猝发的子离子扫描模式，可实现母离子全扫描模式下对目标化合物进行选择性子离子扫描，同时实现筛查与确证功能[14，15]。

根据历年中国农业部办公厅渔用投入品质量安全隐患排查计划，本研究针对渔用投入品中可能造成的风险隐患的各种禁限用药物成分，利用超高压液相色谱静电场轨道离子阱质谱系统，对禁限用药物标准品在统一的参数下进行分析，建立药物色谱质谱信息库，开发禁限用药物筛查与定性确证方法，成功用于对渔用投入品的隐患排查，为我国渔用投入品安全隐患的有效监控提供了新技术。

2实验部分

2.1仪器与试剂

Ultimate 3000超高压液相色谱QExactive静电场轨道离子阱质谱联用系统（附带Xcalibur及racefinder操作与分析软件，美国hermo Fisher 公司）； NEVAP 112氮吹浓缩仪（美国Organomation公司）； 涡旋搅拌器（德国IKA VOEX X3）； CL6R离心机（湘仪离心机仪器有限公司）； 16RXII高速冷冻离心机（日本IACI CF公司）； MilliQ超纯水机（美国Millipore公司）； PL602L电子天平（Mettleroledo公司）； B 125D精密天平（Sartorius公司）； KQ300E超声波提取仪（ 昆山市超声仪器有限公司）。hermo Accucore RPMS色谱分离柱（100 mm × 2.1 mm，2.6 μm， 美国hermo公司）。

53种风险排查物质标准品（见表1）均购于Dr.Ehrenstofer Gmb公司。乙腈、甲醇、乙酸乙酯、丙酮、正己烷、二氯甲烷（色谱纯，Fisher Scientific公司）； 二甲基亚砜、冰醋酸、乙二胺四乙酸二钠 （分析纯，国药集团化学试剂有限公司）； 乙酸铵（PLC 级，Fluka公司）； 甲酸（ACS纯，美国Sigma公司）； 实验用水为超纯水。

2.2实验方法

2.2.1溶液配制称取各药物标准品5 mg左右，以甲醇溶解并定容至50 mL，不易溶解药品可先加入1 mL甲酸或二甲基亚砜溶解，继续配制成100 μg/mL 左右的单标储备液，

2.2.2样品提取方法渔药： 准确称取各渔药500 mg（液体药品以移液枪量取500 μL），以乙腈（含1%甲酸） 25 mL充分溶解， 8000 r/min离心30 min，取上清液待用。

渔用饲料： 将渔用饲料充分混匀均质，称取样品（5.00 ± 0.05）g于50 mL离心管中，加入0.1 g 乙二胺四乙酸二钠（Na2EDA）以及水乙腈溶液（1∶9， V/V， 含1%甲酸）提取剂25 mL， 混合，常温涡旋振荡提取5 min，超声溶解20 min， 8000 r/min离心30 min，取上清液待用。

2.2.3色谱分析条件Accucore RPMS色谱柱（100 mm × 2.1 mm， 2.6 μm）； 流速： 0.3 mL/min； 柱温： 30℃； 进样量： 20 μL； 流动相A为水（含0.1%甲酸），流动相B为乙腈（含0.1%甲酸）； 洗脱梯度： 0～3.0 min，5% B； 3.0～22.0 min，5%～100% B； 22.0～25.0 min，100% B； 25.0～25.1 min，100%～5% B； 25.1～30.0 min，5% B。

2.2.4质谱分析条件ESI离子源，喷雾电压： 3200 V（+），2800 V（-）； 鞘气： 40 arb； 辅气： 10 arb； 吹扫气： 1 arb； 气体加热温度： 350℃； 离子传输管温度： 325℃； 质谱数据获取模式： Fullscan ddMS2 （opN） 扫描模式。

2.2.5定性筛查信息库、筛查确证、定量方法收集整理各筛查药物分子式，以获知其分子量、分子离子峰、质荷比等信息，在优化的色谱和质谱检测条件下，获得以100 ng/mL药物标准品的色谱保留时间与母离子和子离子信息，在racefinder中创建各药物的筛查比对信息库。对处理好的待筛查样品采用Fullscan ddMS2 （opN）质谱采集方法上机分析，通过已建立好的各药物质谱数据信息库对待筛查样品的数据进行比对筛查、确证。以同样的方法对10，50，100，500和1000 ng/mL浓度的混合标准工作液进行分析，通过racefinder对定性筛查出的阳性药物选择母离子进行定量分析。

3结果与讨论

3.1实验条件的优化

3.1.1提取剂的选择渔药属于纯度较高的药品，杂质较少，采用合适的溶剂直接溶解即可获得较高的提取效率。而对于渔用饲料，考虑采用混合提取剂进行其中药物的提取。由于磺胺类、喹诺酮类在酸性条件下更容易被溶解提取，五氯酚钠在酸性条件下变为五氯酚，从而可溶于有机溶剂，其它药物（孔雀石绿、结晶紫、硝基呋喃类、喹乙醇、己烯雌酚、阿维菌素类、氯霉素类等）易溶于乙腈及其酸性溶液中，而三唑磷在酸碱介质中易水解，故提取剂酸度不宜过高，因而采用水乙腈溶液（1∶9， V/V， 1%甲酸）。而四环素在纯乙腈及酸化乙腈中的提取效率均较低，参考相关研究，加入提取液前加入Na2EDA可将四环素的提取效率提高至60%，同时保证其它药物的提取效率在70%以上[16]。

3.1.2净化条件的优化将提取液以水（含0.1%甲酸）稀释10倍后，分别在LB、中性氧化铝和C18固相萃取柱上负载、洗脱收集及溶解分析，3种小柱对大部分化合物的回收率均不理想，多低于40%，特别是四环素类、五氯酚钠及部分磺胺类等强极性药物极易丢失，回收率低于10%。采用直接稀释基质方法进行净化，对于乳液制剂及有较多固体基质溶解的药品和渔用饲料，取其提取液100 μL用900 μL水乙腈溶液（5∶95， V/V， 含0.1%甲酸）稀釋，各杂质成分浓度降低90%，基质效应干扰大大降低，保证了各药物的回收率均大于50%。对于部分纯度较高、基本无基质溶出的渔药，直接以1 mL提取剂提取，直接用流动相稀释检测对筛查和定量分析并不产生影响。

3.1.3液相色谱条件的优化采用双流动相条件下梯度洗脱模式，考察了在不同酸碱度以及缓冲盐存在条件下各药物分离及离子化效率。以纯水为水相，甲醇或乙腈为有机相， 可在25 min内洗脱所有目标物，但乙腈对四环素类、磺胺类的色谱分离后信号响应和峰形均较好。甲酸的加入可明显提高硝基呋喃类、孔雀石绿、结晶紫、磺胺类、喹诺酮类和四环素的正离子化效率，但部分降低了氯霉素类以及五氯酚钠的负离子化效率。本研究最终采用水（含0.1%甲酸）与乙腈（含0.1%甲酸）作为流动相，在0～25 min 内依次按极性由强到弱洗脱各化合物，目标物的峰形较好，并保持了较高的检测灵敏度。

3.1.4质谱条件的优化本研究采用Full Scan /ddMS2（opN）质谱扫描模式采集数据，可连续对洗脱化合物进行全谱扫描，当母离子的信号强度超过设定阈值时，选取单次扫描最强的若干母离子进行子离子扫描，所获得的均为高分辨数据，在筛查与确证过程中具有很强的可信度。采用以上扫描模式获取的数据对药物进行筛查与确证后，同时以母离子进行定量分析，实现了对药物的准确筛查定性和定量，部分药物的提取离子流图如图1所示。

3.2药物筛查信息库建立

各药物的筛查比对信息如表1所示，部分化合物为同分异构体，且在质谱中第一、第二强的子离子信号相同，但其保留时间不同， 故可进行有效区分。

3.3基质效应

基质效应的评价通过如下公式计算： 基质效应=（1-基质空白溶液加标信号强度/空白溶剂加标信号强度）×100%。渔药和渔用饲料提取液在前处理过程中通过溶剂稀释，将基质浓度降低了10倍，其在实际检测过程中基本不受基质效应影响，结果表明，所有待筛查药物的基质效应均小于15%，属于低基质效应影响，故在实际定量分析过程中省略基质加标曲线分析过程。

3.4筛查与确证

对药物标准品与空白加标样品进行分析比对时，各类信息重复性和稳定性由优到差依次为： 母离子质量数、保留时间、子离子中最强的两个离子质量数及丰度比、子离子其它离子信息。本研究根据比对信息的稳定性，在对样品的筛查过程中，依次需要满足以上前3个条件，方可确定样品中阳性组分的存在。通过Xcalibur获取数据，并通过racefinder编辑药物的比对信息，按照确定的比对标准进行筛查确证与定量分析，最终实现了对实际渔用投入品的各药物的定性筛查与定量分析。

3.5方法学考察

对配制的1～10 ng/mL各标准品进行检测，通过筛查数据库进行定性筛查确证，结果表明，隐色结晶紫、伊维菌素在10 ng/mL水平下均可检出； 呋喃妥因、呋喃西林、噁喹酸、氟甲喹、培氟沙星、土霉素、金霉素、阿维菌素在5 ng/mL下均可检出； 其它药物均可在1 ng/mL水平下检出。针对渔用投入品中禁限用药物的筛查可基于较高检出限条件下进行，即使添加药物含量为5 mg/kg，经过前处理过程后均超过以上检出限，完全可满足实际筛查需要。在检测浓度范围内，各药物标准品保持了良好的线性关系，线性相关系数均大于0.98，保证了渔用投入品的筛查与定量结果准确性。

对不同的渔用饲料及渔药基质分别添加浓度为10 和100 mg/kg的混合药物，筛查与定量结果表明，各药物的检出率为100%，在渔药基质中各药物的回收率>90%，相对标准偏差<5%； 而在各饲料基质中，各药物的回收率>50%，两个加标水平的每种药物的定量结果的相对标准偏差均小于15%（表2）， 表明本筛查方法的定量分析结果具有很好的准确性和精密度。

3.6實际样品分析

将本方法应用于华东地区的渔用投入品质量安全隐患排查项目中68个样品的分析，采用建立的药物筛查数据库进行53种化合物的分析，对于饲料样品通过基质空白加标进行回收率校正，对于渔药样品直接进行定量分析。在29个渔用兽药样品中，检出15种在说明书中未明确标明的筛查药物，且检出含量均超过100 mg/L，结果如表3所示。

4结 论

本研究针对渔用投入品中可造成风险隐患的禁限用药物成分在投入品中高含量特点，通过简单的提取与稀释净化方法，利用超高压液相色谱串联静电场轨道离子阱质谱系统，对禁限用药物在统一的参数下进行分析，建立药物色谱质谱数据库，开发禁限用药物同时筛查、定性确证与定量方法，成功应用于渔用投入品中禁限用的药品的隐患排查。

Abstracto screen the illegal substances in fishery inputs， we established the database including the precursor and the daughter ions for these possible components by the quadrupole/orbittrap mass spectrometer， and the retention time of each drug on the same chromatographic column. And then， the extracted and diluted samples were analyzed and the components in the real samples were identified under the same conditions. Chromatographic analysis was performed on an Accucore RPMS column （100 mm × 2.1 mm， 2.6 μm） using gradient elution with 0.1% formic acid in water and 0.1% formic acid in acetonitrile as mobile phase. Elutes were ionized through heatable electrospray ionization （ESI） in both positive and negative mode simultaneously. Data acquisition was conducted by Fullscan ddMS2 （opN） mode， in which the full mass profile for a continuous precursor ion injection and the fragments of each high abundant precursor of targeted were acquired with excellent time and mass resolution. Screening was carried out through comparison of the information of real samples with that of standards in the database， which were processed by software （racefinder）. he Quantification of each component was analyzed based on the precursor ion chromatography acquired by orbittrap mass spectroscopy， which showed a good linearity between 0.01-1 μg/mL， with R>0.98. he method was validated by checking its minimum screening concentration （0.5 mg/L for drugs and 5 mg/L for feedstuffs） and evaluating the recovery after addition of the standard mixture in real samples （>50%， under the addition of 10 and 100 mg/kg）. he results for 68 practical samples demonstrated the effective performance of this method for screening with highthroughput， rapidness and acceptable minimum screening concentration and accuracy， in which 15 of 29 fishery drug samples were screened out for positive components that were not indicated in their labels.

KeywordsFishery drug； Screen； igh resolution mass spectroscopy