两种酵素产品抗氧化活性分析

陈爽，朱显峰

（河南大学生命科学学院生物工程研究所，河南开封475004）

两种酵素产品抗氧化活性分析

陈爽，朱显峰*

（河南大学生命科学学院生物工程研究所，河南开封475004）

试验通过复合酵素对羟自由基、超氧阴离子自由基和DPPH自由基的清除能力以及还原力的大小的测定，来评价、比较两种酵素产品的体外抗氧化能力。结果表明：试验范围内，酵素产品在体外的抗氧化性良好，抗氧化能力总体上与0.1g/L抗坏血酸相当；其中，产品A的抗氧化性能优于产品B，产品A的总酚含量可达280mg/mL。

酵素；自由基；还原力；总酚

酵素与人类的生活息息相关，近些年来，研究者越来越多的关注酵素的研究。酵素有个正式的名字--酶，它的产生类似堆肥的原理。它是以一种或多种水果、蔬菜为原料，经多种有益菌发酵而成[1]，这种经复合发酵得到的棕色液体称为混合发酵液。这种混合发酵液中除了含有酵素原材料中丰富的营养物质之外，还含有发酵过程中产生的多种活性物质，如各种酶、有机酸、酚类、氨基酸等。酵素在食品和医药等领域中具有很广泛的应用，酵素也可预防现代文明病、解酒护肝、美容，并且其在女性的健康中也有着不可或缺的作用[2-5]。

传统上，物质与氧结合生成氧化物的过程称为氧化，人体内的氧化是一种生物化学过程。体内的氧化伴随着新陈代谢时时刻刻都在进行，氧化的结果会生成许多自由基，自由基或氧化剂会将细胞和组织分解，影响新陈代谢并加速衰老，进而引发各种健康问题。据文献记载，衰老或许多疾病被证实与活性氧和自由基有关联[6-8]。因此，若能够消除过多的自由基，将会预防许多自由基引起的衰老及相关疾病。抗氧化剂的抗氧化活性主要表现在抑制脂质氧化降解、清除活性氧、清除自由基、螯合过渡金属和还原能力等几方面。酵素产品的抗氧化活性对活性氧与几种自由基有显著的清除作用，例如其中的超氧化物歧化酶（SOD）体内活性氧的清除作用[9]。生物体内对活性氧和自由基的清除作用，使其在生命研究领域具有良好的应用前景。

酚类物质是很好的抗氧化剂[10]，如儿茶素能清除体内的自由基，使自由基变为稳定的分子状态，阻断其传递电子，阻止机体的氧化损伤；此外，儿茶素对Fe3+的还原能力，是VC相对还原能力的11.76%[11]。

酵素发酵液对超氧阴离子自由基、羟自由基和DPPH自由基均有一定的清除能力，它对物质的还原能力，以及其中含有的大量酚类物质，赋予这种复合酵素在体外的抗氧化能力。酵素抗氧化活性对机体代谢有积极的影响，人体含有的酵素越多，人就越健康。实验室将购于市场上的新鲜水果或蔬菜按一定比例，装入5 L发酵罐中，密封，常温常压发酵半年，得到复合发酵液——以下统称酵素产品，来进行体外抗氧化实验。通过对酵素产品抗氧化活性的研究可以为酵素产品在医药健康等领域的进一步发展提供参考，提高人们的生活质量。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试材料

将市售新鲜的富士苹果、砀山梨、海南香蕉、巨峰葡萄以及白心火龙果作为A组，本地西红柿、白萝卜、芹菜、白菜、黄瓜作为B组，洗净晾干，按照一定的质量比，在超净工作台中加入适量的无菌白砂糖，均匀平铺于5 L玻璃罐中，补水至刻度，密封，并定期释放产生的气体，避免染菌。利用各种水果自身携带的微生物，使昼夜温差保持在10℃，常压密闭发酵半年，得到两种酵素产品。

1.1.2 试验试剂

Tris、邻苯三酚、盐酸、30%双氧水、FeSO4、水杨酸、无水乙醇、DPPH、甲醇、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、铁氰化钾、三氯乙酸、FeCl3、Folin-酚、碳酸钠、焦性没食子酸、抗坏血酸，以上试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

Eppendorf5810R台式高速冷冻离心机：德国艾本德股份公司；PHB-1型便携式酸度计：杭州真立龙仪器有限公司；CP213电子天平：奥豪斯仪器（上海）有限公司；FA124电子天平：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；INESA 752N紫外可见分光光度计：上海仪电分析仪器有限公司；玻璃仪器气流烘干器C型：河南省予华仪器有限公司；数显恒温水浴锅HH-6：国华电器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 超氧阴离子自由基（O2－·）清除能力测定

采用邻苯三酚自氧化法[11-12]。邻苯三酚在碱性条件下能迅速自氧化，释放出O2－·，生成黄色的中间产物，在325 nm处测定溶液的吸光度。利用抗坏血酸作为对照组。用石英比色皿于325 nm处测其OD值。

1.3.2 羟自由基（·OH）清除能力测定

H2O2与Fe2+混合反应会产生·OH，在体系内加入水杨酸捕捉·OH并产生有色物质，该物质在510 nm下有最大吸收。参照徐建东[12]的方法，利用此原理对酵素的羟基自由基清除能力进行测定。抗坏血酸作为对照组存在；用玻璃比色皿于510 nm处测其OD值。

1.3.3 DPPH自由基（DPPH·）清除能力测定

DPPH自由基是较稳定的有机自由基，其在甲醇溶液中呈紫色，在517 nm处有较强吸收峰，在有自由基清除剂存在时，DPPH醇溶液有褪色情况出现，其褪色程度与DPPH自由基被清除量有关，可用比色法进行定量[11]。抗坏血酸作为对照组存在；用玻璃比色皿于517 nm处测其OD值。

1.3.4 还原力与总酚含量的关系试验

分别取两种酵素产品额梯度稀释液进行试验，以蒸馏水作为空白对照，用玻璃比色皿于760 nm处测其OD值，根据线性方程A=0.018 4C+0.004 6，R2=0.999 7来计算总酚含量，其中：A为吸光度，C为样品浓度（mg/mL）[12]。还原力的测定参照程德竹[13]的方法，以蒸馏水代替样品作为空白对照；用玻璃比色皿于700 nm处分别测其OD值。以对应浓度测得还原力的大小为横坐标，总酚含量为纵坐标进行线性拟合。

2 结果与分析

2.1 对自由基清除能力及总酚含量的测定

按照公式：清除率/%=[A0-（Ai-Aj）]/A0×100，计算酵素产品对自由基的清除率。其中：Ai是样品测得的吸光度值，A0为水代替待测液时测得的吸光度值；Aj为水代替反应试剂时待测液不同浓度下测得的吸光度值。

对自由基的清除能力见图1。

图1 对自由基的清除能力Fig.1 Free radicals scavenging ability

由图1可以看出，两种酵素产品对羟基自由基、超氧阴离子与DPPH自由基均有一定的清除能力，其中对DPPH自由基和超氧阴离子自由基的清除能力均在85%以上，而对羟基自由基的清除能力略低。就两种酵素产品而言，产品A的整体清除能力较产品B高5%左右，且二者对超氧阴离子自由基的清除能力都高达90%以上；与0.1 g/L抗坏血酸相比，两种酵素产品对超氧阴离子自由基的清除能力较高，而清除DPPH自由基的能力与抗坏血酸基本持平，羟基自由基的清除能力明显低于抗坏血酸。

2.2 还原力与总酚含量的关系分析

随酵素产品浓度的增加，其酚类物质随之增加，还原力水平也越来越高，并且还原力的增加与总酚浓度表现出较好的线性关系，产品A的总酚含量高于产品B，如图2。两种产品还原力与总酚含量的相关性R均可达到0.99。

图2 还原力与总酚含量的相关性Fig.2 The correlation between reducing capacity and total phenol content

3 结论

本试验通过两种酵素产品对超氧阴离子自由基，羟自由基、DPPH自由基的清除能力以及还原力的大小的测定，发现酵素产品在体外的抗氧化性良好，抗氧化能力总体上与0.1 g/L抗坏血酸相当；其中，产品A对自由基的清除能力与总酚含量均高于产品B，说产品A的抗氧化性能优于产品B。由于酵素产品中含有具有抗氧化活性的酚类物质，使其还原力非常高。产品A的总酚含量也高于产品B，可达280mg/mL。两种酵素产品还原力与总酚含量的线性相关R均可达0.99，而酚类物质是具有抗氧化活性的主要原因，其与抗氧化活性的线性相关可达0.97[15]，由此可知，表明还原能力与多种抗氧化机制有关。

酵素产品良好的抗氧化性能及其还原力与抗氧化机制的关系，引发以后对水果与蔬菜的综合作用，来发酵更高质量的酵素产品，为以后酵素产品的全面开发与应用做好一定的铺垫，将会推动果蔬复合酵素未来在人类健康方面的发展与应用。

[1]毛建卫,吴元峰,方晟.微生物酵素研究进展[J].发酵科技通讯, 2010,39(3):42-44

[2]梁捷.生物酵素产业诞生记[N].光明日报,2015-05-19(008)

[3]刘丽华,张艳梅,王景芳,等.“动物酵素营养液”在家禽饲养上应用效果[J].养殖技术顾问,2014(11):294-295

[4]李景松,姜忠丽.糙米酵素提取物抗氧化活性作用研究[J].农业科技与设备,2015,6(6):60-64

[5]杨丽华.马尾松松针抗氧化活性研究及其抗氧化功能饮料研制[D].广州:广州医科大学,2014

[6]蒋增良.天然微生物酵素发酵机理、代谢过程及生物活性研究[D].杭州:浙江理工大学,2012

[7]Rattan S IS.Theories of biological aging:Genes,proteins,and free radicals[J].Free Radical Research,2006,40(12):1230-1238

[8]Chen H Y,Yen GC.Antioxidant activity and free radical-scavenging capacity of extracts from guava(Psidiumguajava L.)leaves[J]. Food Chemistry,2007,101(2):686-694

[9]张怡,路铁刚.植物中的活性氧研究概述[J].生物技术进展, 2011,1(4):242-248

[10]李思荻.高抗氧化能力豆类的筛选及其黄酮类物质消化吸收效果的评价[D].大庆:黑龙江八一农垦大学,2010

[11]赵文红,邓泽元,范亚苇,等.儿茶素体外抗氧化作用的研究[J].食品科技,2009(12):278-282

[12]徐建东.槲皮素衍生物的合成及其抗氧化活性研究[D].济南:山东师范大学,2013

[13]程德竹,杜爱玲,李成帅,等.生姜提取物对邻苯三酚自氧化生成超氧自由基的清除[J].中国调味品,2014,39(11):35-39

[14]董银卯,何聪芬,王领,等.火龙果酵素生物活性的初步研究[J].食品科技,2009(3):192-196

[15]陆健,樊伟,孔维宝,等.大麦总多酚不同溶剂提取物对DPPH自由基清除能力的影响[J].食品与生物技术学报,2008,27(1):57-61

[16]朱晓庆,陈义伦,张亚伟,等.红茶菌发酵过程中抗氧化能力的变化规律[J].食品与发酵工业,2010,36(11):111-114

Analysis on Antioxidant Activity of Two Natural-ferments

CHEN Shuang，ZHU Xian-feng*
（Institute of Bioengineering，College of Life Science，Henan University，Kaifeng475004，Henan，China）

In this experiment，the scavenging effect evaluated the antioxidant activity of two miciobial natural-ferments on·OH，O2－·，DPPH·and reducing capacity.The results showed that the two ferments both had well performance in vitro antioxidant activity and as excellent as ascorbic acid（0.1 g/L）.Ferments A was quite significant than B，its total phenol content was 280mg/mL.

natural-ferments；radical；reducing capacity；total phehol

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.03.008

2016-05-22

陈爽（1990—），女（汉），硕士研究生，研究方向：微生物学专业，生物物质分离方向。

*通信作者