不同提取方法对迷迭香提取及抗氧化效果的影响

张泽生，郭擎，高山，王春龙，孙艳伟，李铭

（1.天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457；2.天津食品安全低碳制造协同创新中心，天津300457）

不同提取方法对迷迭香提取及抗氧化效果的影响

张泽生1，2，郭擎1，高山1，王春龙1，孙艳伟1，李铭1

（1.天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457；2.天津食品安全低碳制造协同创新中心，天津300457）

为了进一步优化迷迭香抗氧化剂的提取方法，采用响应面法分析回流提取和超声辅助提取对迷迭香粗提物中总酚含量的影响，并通过体外抗氧化实验来评价其抗氧化活性。结果表明，回流法提取迷迭香的最佳工艺条件为：乙醇浓度80%，温度80℃，时间1 h，料液比1∶10（g/mL），得到总酚含量为33.85mg/g。超声辅助提取迷迭香的最佳工艺条件为：温度50℃，时间40min，料液比1∶10（g/mL），乙醇浓度80%，得到总酚含量为36.58mg/g。超声辅助提取物的抗氧化效果优于回流提取物。

迷迭香；响应面；抗氧化

长期以来，人们一直使用合成抗氧化剂进行食品及油脂类的抗氧化和保鲜。研究表明，传统合成抗氧化剂如叔丁基对羟基茴香醚（BHA）、二丁基羟基甲苯（BHT）等本身可能具有潜在毒性，对人体造成危害[1]。另外合成抗氧化剂在高温时容易逸失[2]。所以具有安全性高、抗氧化能力强等特点的天然抗氧化剂日益受到重视。迷迭香是具有高效抗氧化效果的植物。在我国，对迷迭香的研究开展较晚，1992年常静[3]等通过研究发现，迷迭香提取物具有高效的抗氧化效果且强于合成抗氧化剂BHT。目前，迷迭香的主要提取方法有回流法、超声辅助提取法以及超临界萃取法[4-6]。但是在以往的提取研究中往往只针对某一种有效成分。除鼠尾草酸、鼠尾草酚、迷迭香酸、迷迭香酚外，迷迭香提取物中还有其他酚类成分，并且各抗氧化成分之间存在协同作用，因此不能就某一种成分的含量来简单的判断抗氧化剂的优劣，迷迭香抗氧化剂的提取方法有必要进行进一步优化。本文旨在研究不同提取方法对迷迭香提取物的总酚含量以及抗氧化效果的影响。为寻找高效、经济、快速的迷迭香提取方法提供依据。

1 试验材料

1.1 材料

迷迭香叶：安徽胜豪中药材销售有限公司；福林酚试剂、TPTZ、DPPH、ABTS标准品（纯度>98%）：鼎国昌盛生物技术有限责任公司；其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

HH.SY11-Ni2电热恒温水浴锅：天津市欧诺仪器仪表有限公司；SB25-12DTDN超声波清洗机：宁波新芝生物科技有限公司；SP-2102UV紫外分光光度计：日本岛津有限公司。

2 方法

2.1 Folin-Ciocalteu法测定总酚含量

精确称取10mg没食子酸标品，置于10mL容量瓶中，加95%乙醇适量，溶解后定容至刻度，摇匀，即得没食子酸标准储备液。

精确量取没食子酸标准储备液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL，分别置于10mL容量瓶中，加入95%乙醇定容至刻度，即得没食子酸工作液，浓度为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06mg/mL。

2.1.1 标准曲线的制作

精确量取1mL不同浓度的没食子酸工作液，加入5 mL 10%的福林酚溶液，摇匀，静置5 min，再加入4mL 7.5%的Na2CO3溶液，摇匀，静置60min。以相应的试剂为空白，在765 nm波长处测定其吸光度值。以没食子酸工作液浓度为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线。

2.1.2 样品中总酚含量的测定

精确称量提取液浓缩至干后所得提取物，用乙醇溶解定容至10mL的容量瓶中，稀释至合适的浓度，测定条件和方法同“2.1.1”项下。

2.2 提取工艺条件优选

2.2.1 回流法提取

2.2.1.1 响应面设计

在单因素试验基础上，以乙醇浓度、料液比、提取温度、提取时间作为自变量，以总酚含量为响应值，按照Box-Behnken试验设计原理设计四因素三水平试验，试验因素和水平见表1。

表1 回流法响应面试验因素水平表Table1 Independent variables and their levels used in the response surface design of reflux method

2.2.1.2 提取方法

准确称取5 g除去精油的迷迭香粉末，以一定体积的乙醇在一定温度下进行回流提取2次，过滤，合并滤液，浓缩至干，测定其中总酚含量。

2.2.2 超声波辅助提取

2.2.2.1 响应面设计

在单因素试验基础上，以乙醇浓度、料液比、提取温度、提取时间作为自变量，以总酚含量为响应值，按照Box-Behnken试验设计原理设计四因素三水平试验，试验因素和水平见表2。

表2 超声辅助提取响应面试验因素水平表Table2 Independent variables and their levels used in the response surface design of ultrasonic assisted method

2.2.2.2 提取方法

准确称取5 g除去精油的迷迭香粉末，以一定体积的乙醇在一定温度下进行超声波辅助提取2次，过滤，合并滤液，浓缩至干，测定其中总酚含量。

2.3 不同提取方法所得抗氧化剂的的抗氧化性测定

通过响应面试验可得到回流法提取和超声辅助提取的较优提取工艺，在较优工艺条件下提取迷迭香并进行抗氧化试验。

2.3.1 DPPH自由基清除率的测定

精确称量5mg DPPH溶于200mL 80%乙醇中得DPPH乙醇溶液，加样后立即用漩涡振荡器混匀，暗反应30min后于517 nm下测定吸光度。按照下面公式计算样品对DPPH自由基的清除率。

式中：A0为1mLDPPH溶液+0.2mL样品溶剂的吸光度值；Ai为1mLDPPH溶液+0.2mL样液的吸光度值；Aj为1mL无水乙醇+0.2mL样液的吸光度值。

2.3.2 ABTS+自由基清除率的测定

用pH7.4的磷酸盐缓冲溶液配制2.45 mmol/L过硫酸钾溶液和7mmol/L ABTS溶液；将过硫酸钾溶液和ABTS溶液按体积比1∶1的比例混合，即为ABTS储备液，室温下保存12 h～16 h，备用，将ABTS+·储备液用乙醇稀释至吸光度值为0.700±0.02。精确量取100μL不同浓度样品溶液，加入900μL稀释后的ABTS+·溶液，以乙醇代替样品为空白，室温下反应1 min，在734 nm处测定吸光度，分别记为A样和A空，按下式计算清除率。

2.3.3 迷迭香提取物总还原力测定

精确量取200μL不同浓度的样品溶液，依次加入500μL磷酸盐缓冲液（pH值为6.6，0.2 mol/mL）及500μL 1%的K3Fe（CN）6溶液，于50∶的水浴中反应20min后冷却至室温，加入500μL 10%的三氯乙酸溶液，充分反应后，精确量取500μL反应液，并加入500μL蒸馏水和100μL 0.1%的FeCl3溶液，混匀后反应10min，在700 nm处测定吸光度。

2.3.4 FRAP法测定迷迭香提取物总抗氧化能力

2.3.4.1 标准曲线的制作

用10mmol/L TPTZ溶液、20mmol/L FeCl3溶液和0.3mol/L醋酸钠溶液按体积比1∶1∶10的比例混合，即为TPTZ工作液。精确量取100μL不同浓度的FeSO4溶液，加入900μL提前预热至37℃的TPTZ工作液，混匀后反应10min，在593nm处测定吸光度。以FeSO4溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

2.3.4.2 样品总抗氧化能力的测定

精确量取100μL不同浓度的样品，测定方法和条件同“2.3.4.1”项下，结果以FeSO4浓度表示。

3 结果与分析

3.1 没食子酸标准曲线的建立

标准曲线如图1所示。进行线性回归，得到回归方程y=18.171x-0.009 3，R2=0.999 0。表明没食子酸质量浓度与吸光度有良好的线性关系。

图1 没食子酸标准曲线Fig.1 Standard curve of GallicAcid

3.2 回流法响应面试验结果与分析

根据Box-Behnken设计方案，试验结果见表3。

表3 回流法响应面试验设计及结果Table3 RSM design and total phenolic compounds of reflux method

利用Design-Expert8.0.6软件对表3试验数据进行二次多项式回归拟合，得到回归方程：Y=33.39-1.75A-0.55B+3.87C+0.79D-2.33AB-0.27AC-0.22AD-0.28BC-0.59BD+0.28CD-7.43A2-3.32B2-6.07C2-3.03D2。

各因素方差分析见表4。

从表4中可以看出，该回归模型极显著（P＜0.0001）。失拟项P=0.8101，不显著，说明该模型可用于检测。修正R2为96.52%，说明总变异种仅有3.48%不能用该模型解释。R2=98.26%，表明迷迭香提取物中总酚含量的预测值与实际值之间具有较好的拟合度。因此该模型可用于预测、分析迷迭香提取物中总酚的实际含量。

表4 回流法提取回归模型的方差分析Table4 Analysis of variance of regression equation by reflux method

另外从表4中还可以看出，4个因素中只有温度对总酚含量影响不明显，其余3个因素对提取物中的含量都有显著影响。乙醇浓度和温度（AB）对总酚含量的交互影响显著，而其余几个交互作用不显著。

经响应面分析得到，回流法提取的优化工艺条件为乙醇浓度78.85%、温度79.29℃、时间1.16 h、料液比1∶10.32（g/mL），预测总酚含量为34.21mg/g。实际操作中修正后条件为乙醇浓度80%、温度80℃、时间1 h、料液比1∶10（g/mL），得到总酚含量为33.85mg/g。与预测值基本一致，表明经过响应面得到的提取条件可行。

3.3 超声辅助提取响应面试验结果与分析

根据Box-Behnken设计方案，试验结果见表5。

表5 超声辅助提取响应面试验设计及结果Table5 RSM design and total phenolic compounds of ultrasonic assisted method

续表5 超声辅助提取响应面试验设计及结果Continue table5 RSM design and total phenolic compounds of ultrasonic assisted method

利用Design-Expert8.0.6软件对表5实验数据进行二次多项式回归拟合，得到回归方程：

各因素方差分析见表6。

表6 超声辅助提取回归模型的方差分析Table6 Analysis of variance of regression equation by ultrasonic assisted method

续表6 超声辅助提取回归模型的方差分析Continue table6 Analysis of variance of regression equation by ultrasonic assisted method

从表6中可以看出，该回归模型极显著（P＜0.0001）。失拟项P=0.8125，不显著，说明该模型可用于检测。修正R2为91.51%，说明总变异种仅有8.49%不能用该模型解释。R2=95.75%，表明迷迭香提取物中总酚含量的预测值与实际值之间具有较好的拟合度。因此该模型可用于预测、分析迷迭香提取物中总酚的实际含量。

另外从表6中还可以看出，几个因素间的交互作用对总酚含量影响均不显著。

经响应面分析得到，超声辅助提取的优化工艺条件为温度49.09℃、时间40.87min、料液比1∶10.22（g/ mL）、乙醇浓度79.39%，预测总酚含量为36.04mg/g。实际操作中修正后条件为温度50℃、时间40min、料液比1∶10（g/mL）、乙醇浓度80%，得到总酚含量为36.58mg/g。与预测值基本一致，表明经过响应面得到的提取条件可行。

3.4 抗氧化活性结果与分析

不同提取方法得到迷迭香提取物的体外抗氧化活性如图2所示。

图2 迷迭香提取物抗氧化活性Fig.2 Antioxidant activity of rosemary extract

图2 中可以看出，通过超声辅助提取和回流法提取得到的迷迭香提取物都有明显的抗氧化效果，且与浓度呈正相关，但在浓度较低时均不如VC。在DPPH自由基清除试验中超声辅助提取物的IC50值为95.96μg/mL，回流提取物的IC50值为128.06μg/mL，VC的IC50值为10.30μg/mL。在ABTS+自由基清除试验中超声辅助提取物的IC50值为66.75μg/mL，回流提取物的IC50值为91.06μg/mL，VC的IC50值为26.04μg/mL。总的来说，超声辅助提取得到的迷迭香提取物抗氧化效果优于回流法提取得到的迷迭香提取物。这是因为超声辅助提取温度较低，且超声可以使细胞壁破碎，使最终得到的提取物中总酚含量较高。回流提取则温度较高，虽同样可以使细胞壁破碎，但在提取过程中一些酚类物质会发生分解及转化，使提取物中总酚含量下降，从而不能达到预期的抗氧化效果。

4 结论

回流法提取迷迭香的最佳工艺条件为：乙醇浓度80%，温度80℃，时间1 h，料液比1∶10（g/mL），得到总酚含量为33.85mg/g。超声辅助提取迷迭香的最佳工艺条件为：温度50℃，时间40min，料液比1∶10（g/ mL），乙醇浓度80%，得到总酚含量为36.58mg/g。超声辅助提取较回流法提取，提取温度更低，时间更短，提取物中总酚含量更高。

体外抗氧化试验表明，超声辅助提取物与回流提取物的DPPH·、ABTS+·清除能力，总抗氧化能力以及还原力均与浓度呈正相关。超声辅助提取物的抗氧化效果优于回流提取物。因此，超声辅助提取法更适用于迷迭香提取，超声辅助提取得到的迷迭香提取物也可作为新型天然抗氧化剂。

[1]秦天苍,于新华,葛宁,等.天然抗氧化剂在食用油中应用价值探讨[J].食品加工,2009,5(1):34-36

[2]Chang SS,Ostric-Matijasevic B,Hsieh OAL,et al.Natural antioxidants from rosemary and sage[J].Journal of Food Science,1977,42 (4):1102-1106

[3]常静,肖绪玲,王夺元.我国引种的迷迭香抗氧化成份的分离和抗氧化性能研究[J].化学通报,1992,3(7):30-35

[4]董文宾,田家乐,谢金玉,等.迷迭香天然食用抗氧化剂提取工艺研究[J].西北轻工业学院学报,1991,9(2):47-51

[5]杨海麟,鲁时瑛,杨胜利,等.迷迭香抗氧化剂的提取方法研究[J].天然产物研究与开发,2002,14(4):20-23

[6]黄纪念,屠鹏飞,蔡同一.迷迭香天然抗氧化剂的超临界流体萃取工艺研究[J].食品添加剂,2003,24(10):131-132

Effects of Different Extraction Methods on the Extraction and Antioxidation of Rosemary

ZHANG Ze-sheng1，2，GUO Qing1，GAO Shan1，WANG Chun-long1，SUN Yan-wei1，LI Ming1
（1.School of Food Engineering and Biological Technology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China；2.Tianjin Food Safety and Low Carbon Manufacturing Collaborative Innovation Center，Tianjin 300457，China）

In order to optimize the method for extracting rosemary antioxidant，response surface methodology was used to analyze the effect of reflux extraction and ultrasonic assisted extraction on the content of total phenolic compounds in crude extract of rosemary.The antioxidant activities of the crude extraction were evaluated in vitro antioxidant experiment.The results indicated that the highest extraction yield of total phenolic compounds using the reflux extraction could obtain up to 33.85mg/g under the following conditions：ethanol concentration of 80%as solvent，liquid to solid ratio of 1∶10（g/mL），extraction for 1h at the temperature of 80℃.The highest extraction yield of total phenolic compounds using the ultrasound-assisted extraction could obtain up to 36.58mg/g under the following conditions：ethanol concentration of 80%as solvent，liquid to solid ratio of 1∶10（g/mL），extraction for 40 min at the temperature of 50℃.The antioxidant effect of ultrasonic-assisted extraction was better than that of reflux extraction.

Rosemary；response surface；antioxidant

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.03.013

2016-05-05

张泽生（1956—），男（汉），教授，博士，研究方向：天然产物活性成分。