何首乌茎叶总黄酮的提取及其抗运动疲劳作用

钱小东，黄伟

（1.湖北第二师范学院体育学院，湖北武汉430205；2.湖北省肿瘤医院妇瘤科，湖北武汉430079）

何首乌茎叶总黄酮的提取及其抗运动疲劳作用

钱小东1，黄伟2，*

（1.湖北第二师范学院体育学院，湖北武汉430205；2.湖北省肿瘤医院妇瘤科，湖北武汉430079）

利用单因素和正交试验对超声波乙醇浸提法提取何首乌茎叶总黄酮的工艺进行优化，并对何首乌茎叶总黄酮的抗运动疲劳作用进行研究。结果表明，超声波乙醇浸提法提取何首乌茎叶总黄酮的最佳提取工艺为：超声时间40min，乙醇浓度70%，料液比1∶40（g/mL），提取温度80℃，在此工艺条件下何首乌茎叶总黄酮的得率可达2.49%。小鼠跑台力竭实验和负重游泳实验表明何首乌茎叶总黄酮具有良好的抗运动疲劳能力。

何首乌茎叶；总黄酮；超声波乙醇浸提；正交试验；抗运动疲劳

何首乌是一种传统的中药资源，具有抗氧化、降血脂、提高机体免疫力、抗衰老，改善记忆能力等多种功效，深受广大消费者喜欢[1-3]。然而，与何首乌的广泛应用不同，何首乌茎叶的深加工产品却很少见，因此一定程度上造成了对何首乌茎叶的浪费[4]。一些研究表明植物的茎叶中含有一定量的黄酮类物质，且具有多种保健功能，如抗氧化、抗衰老、抗突变等，具有广阔的应用价值[5-7]。此外，研究发现天然提取的总黄酮会具有一定的抗运动疲劳的能力[8-10]，因此何首乌茎叶总黄酮是否也具有这样的能力值得进行进一步的研究。在本研究以何首乌茎叶为研究对象，利用超声波乙醇浸提法对何首乌茎叶中的总黄酮进行提取，并利用正交试验对提取参数进行优化，在此基础上对提取的总黄酮物质进行抗运动疲劳的研究。本研究不仅有利于提高何首乌茎叶总黄酮的得率，也能够为拓展何首乌茎叶的开发利用和活性成分研究提供理论依据。

1 材料与仪器

1.1 样品来源

何首乌茎叶：大小均一，且均完好无损，无腐败变质现象，采摘自湖北省孝昌县大别山区。

1.2 材料与试剂

芦丁标准品：北京索莱宝科技有限公司；95%乙醇：沧州鑫安化工；5%苯酚：上海居里生物试剂检测中心；浓硫酸：无锡嘉宏化工贸易有限公司。上述试剂均为分析纯。

小鼠：年龄8周，雄性，体重（20±2）g，购自中国医学科学院实验动物研究所。

1.3 仪器与设备

AB104-N电子分析天平：梅特勒-托利多仪器（北京）有限公司；6050低温真空干燥箱：重庆市松朗电子仪器有限公司；FW80高速万能粉碎机：北京市泰和格润仪器有限公司；KQ-100KDB高功率数控超声波清洗器：苏州市超声仪器有限公司；TU-1901双光束紫外可见分光光度计：普析通用仪器（北京）有限责任公司；小鼠恒温游泳箱，安徽正华生物仪器设备有限公司；小鼠实验跑台，北京达美达科技有限公司；体育运动计时数字电子秒表，深圳万德丰科技有限公司。

2 方法

2.1 何首乌茎叶总黄酮含量的测定

2.1.1 芦丁标准曲线的绘制

根据林海桢等[11]的报道，以芦丁为标准品，在510nm下测定不同浓度芦丁的吸光值，最后以芦丁标准液浓度（mg/mL）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，绘制芦丁标准曲线。

2.1.2 何首乌茎叶总黄酮的制备及含量测定

利用低温真空干燥箱对何首乌茎叶进行干燥，采用万能粉碎机对干燥后的何首乌茎叶进行粉碎，60目筛子过筛得到何首乌茎叶粉末备用。精密称取10 g的何首乌茎叶粉末，加入不同浓度的乙醇，在常温下浸泡20 h后进行超声提取，之后对提取液进行抽滤。何首乌茎叶总黄酮的得率计算公式如下：

式中：C为对应总黄酮的浓度，mg/mL；V为滤液体积，mL；W为得率，%；m为何首乌茎叶提取样本质量，g。

2.2 单因素试验

2.2.1 超声温度对何首乌茎叶总黄酮得率的影响

在乙醇浓度为60%，超声时间为30min，料液比为1∶30（g/mL）的条件下，选择超声温度分别为60、70、80、90、100℃，分析提取温度对何首乌茎叶总黄酮得率的影响。

2.2.2 乙醇浓度对何首乌茎叶总黄酮得率的影响

在超声温度为80℃，超声时间为30min，料液比为1∶30（g/mL）的条件下，选择乙醇浓度分别为50%、60%、70%、80%和90%，分析乙醇浓度对何首乌茎叶总黄酮得率的影响。

2.2.3 超声时间对何首乌茎叶总黄酮得率的影响

在超声温度为80℃，乙醇浓度为60%，料液比为1∶30（g/mL）的条件下，选择超声时间分别为20、30、40、50、60min，分析超声时间对何首乌茎叶总黄酮得率的影响。

2.2.4 料液比对何首乌茎叶总黄酮得率的影响

在超声温度为80℃，超声时间为30min，乙醇浓度为60%的条件下，选择料液比分别为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL），分析料液比对何首乌茎叶总黄酮得率的影响。

2.3 正交试验设计

为了进一步的优化超声波乙醇浸提法提取何首乌茎叶总黄酮的工艺，在单因素试验的基础上设计正交试验。选用超声温度、乙醇浓度、提取时间和料液比4个因素进行优化组合，因素与水平表见表1。

表1 正交试验因素与水平Table1 Factors and levels of orthogonal experiment

2.4 何首乌茎叶总黄酮抗运动疲劳作用

2.4.1 动物分组及给药

取40只小鼠，随机分为4组，对照组（A）为空白对照组，灌胃生理盐水；根据朱一闻等[12]的报道，设计低、中和高剂量的给药组，具体为B为低剂量组，灌胃何首乌茎叶总黄酮5 g/kg/d；C为中剂量组，灌胃何首乌茎叶总黄酮10 g/kg/d；D为高剂量组，灌胃何首乌茎叶总黄酮15 g/kg/d；上述4组小鼠均灌胃30 d，期间小鼠自由饮水和进食。

2.4.2 何首乌茎叶总黄酮对小鼠跑台力竭时间的影响

灌胃第12 d开始，对4组小鼠需进行3 d的跑台适应实验（30min/次/d），速度为20m/min。从第15 d开始对4组小鼠进行一周的跑台力竭实验，力竭速度为20m/min，当小鼠联连续从电网掉下，呼吸急促、视为无法完成跑台实验，此时记录小鼠力竭时间[13]。

2.4.3 何首乌茎叶总黄酮对小鼠负重游泳力竭时间的影响

1992年在天津手表厂基础上，天津市组建成立“天津海鸥手表集团公司”（简称：海鸥表业）。进入二十一世纪，为适应市场需求的变化，海鸥表业集团成立了国家级技术中心和国内钟表行业唯一的博士后工作站，先后设计、研制出“陀飞轮”、“双陀飞轮”、“万年历”、“三问表”、“陀飞轮女表”、“计时码表”等一系列复杂机心手表（图19）。

小鼠末次灌胃30min后，让4组小鼠进行负重游泳实验，负重量为体重的4%，将4组实验小鼠放于水温为25℃，水深为30 cm的游泳箱进行负重游泳实验，记录4只小鼠力竭时间[12]。

2.5 数据分析

实验结果以平均数±标准偏差表示，并利用SPSS17.0软件对实验数据进行分析，选择Tukey’s检验，当P＜0.05时可视为具有统计学意义，差异显著。

3 结果与分析

3.1 单因素试验

3.1.1 超声温度对何首乌茎叶总黄酮得率的影响

在超声温度为60、70、80、90、100℃下分析超声温度对何首乌茎叶总黄酮得率的影响，结果如图1。

图1 超声温度对何首乌茎叶总黄酮得率的影响Fig.1 Effect of ultrasonic extraction temperature on the extraction rate of FSLPMT

3.1.2 乙醇浓度对何首乌茎叶总黄酮得率的影响

在乙醇浓度分别为50%、60%、70%、80%和90%的水平下分析乙醇浓度对何首乌茎叶总黄酮得率的影响，结果如图2所示。

图2 乙醇浓度对何首乌茎叶总黄酮得率的影响Fig.2 Effect of ethanol concentration on the extraction rate of FSLPM T

随着乙醇浓度的增加，何首乌茎叶总黄酮的得率也随之增加，当乙醇浓度达到80%时趋于稳定，因此何首乌茎叶总黄酮提取的最佳乙醇浓度为80%。

3.1.3 超声时间对何首乌茎叶总黄酮得率的影响

在超声时间分别为20、30、40、50、60min的条件下研究超声时间对何首乌茎叶总黄酮得率的影响，结果如图3所示。

图3 超声时间对何首乌茎叶总黄酮得率的影响Fig.3 Effect of ultrasonic extraction time on the extraction rate of FSLPMT

随着超声时间的延长，何首乌茎叶总黄酮的得率随之增加，当超声时间为40min时，得率达到最大。但是当大于40min后，何首乌茎叶总黄酮的得率会随着超声时间的增加而降低，这可能是由于超声波产生的较强的机械振动作用和空化作用，时间长了会破坏提取液中的黄酮类物质，因此何首乌茎叶总黄酮提取的最佳超声时间为40min。

3.1.4 料液比对何首乌茎叶总黄酮得率的影响

在料液比为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）的水平下分析料液比对何首乌茎叶总黄酮得率的影响，结果如图4所示。

图4 料液比对何首乌茎叶总黄酮得率的影响Fig.4 Effect of liquid material ratio on the extraction rate of FSLPMT

随着料液比的增加，何首乌茎叶总黄酮的得率也随之增加，当料液比为1∶40（g/mL）时趋于恒定，因此何首乌茎叶总黄酮提取的最佳料液比为1∶40（g/mL）。

3.2 正交试验

为了得到超声波乙醇浸提法提取何首乌茎叶总黄酮的最佳参数组合，在单因素试验的基础上进行正交试验，并进行方差分析，结果如表2，表3所示。

由表2可知，4个因素对何首乌茎叶总黄酮得率的影响顺序为：乙醇浓度（B）＞超声温度（D）＞超声时间（A）＞料液比（C）；超声波乙醇浸提法提取何首乌茎叶总黄酮的最佳因素水平组合为A2B2C3D2，即超声时间40min，乙醇浓度70%，料液比1∶40（g/mL），提取温度80℃。由表3方差分析可知，4个因素都对何首乌茎叶总黄酮得率有极显著的影响（P＜0.01）。按照上述最优方案进行了3次平行试验，何首乌中总黄酮的得率分别为2.49%、2.45%、2.53%，3次试验的平均值为2.49%，其结果高于正交试验各组得率。

表2 正交实验结果Table2 Results of orthogonal experiment

表3 方差分析Table3 Variance analysis

3.3 何首乌茎叶总黄酮抗运动疲劳作用

3.3.1 何首乌茎叶总黄酮对小鼠跑台力竭时间的影响

何首乌茎叶总黄酮对小鼠跑台力竭时间的影响见表4。

表4 何首乌茎叶总黄酮对小鼠跑台力竭时间的影响Table4 Effects on treadmill exhaustion time of mices of FSLPMT

由表4可知，与空白对照组（A组）小鼠相比，低（B组）、中（C组）和高（D组）剂量组小鼠跑台实验力竭时间随着给药剂量的增加而得到显著的延长（P＜0.05）。这说明何首乌茎叶总黄酮能够增强小鼠的耐力，具有抗运动疲劳的作用。

3.3.2 何首乌茎叶总黄酮对小鼠负重游泳力竭时间的影响

小鼠负重游泳力竭实验结果如图5所示。

图5 何首乌茎叶总黄酮对小鼠游泳耐力的影响Fig.5 Effects on swimming endurance of mices of FSLPMT

与空白对照组（A组）小鼠相比，低（B组）、中（C组）和高（D组）小鼠均能够显著的延长小鼠游泳的力竭时间（P＜0.05），并随着给药量的增加小鼠负重游泳的耐力也得到显著增加（P＜0.05），这进一步说明何首乌茎叶总黄酮具有抗运动疲劳的作用。

4 结论

本研究探讨了何首乌茎叶总黄酮的提取工艺，结果表明，何首乌茎叶总黄酮得率的影响顺序为：乙醇浓度＞超声温度＞超声时间＞料液比，超声波乙醇浸提法提取何首乌茎叶总黄酮的最佳工艺为：超声时间40min，乙醇浓度70%，料液比1∶40（g/mL），提取温度80℃，此条件下何首乌茎叶总黄酮的得率为2.49%，小鼠跑台力竭实验和负重游泳实验表明何首乌茎叶总黄酮具有抗运动疲劳能力。本研究对何[lele8]首乌茎叶总黄酮的提取及深度开发具有指导意义。

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Extraction and Anti-exercise-fatigue Activity of Flavonoids from Stalks and Leaves of Polygonum multiflorum thunb

QIAN Xiao-dong1，HUANG Wei2，*
（1.Department of Physical Education，Hubei University of Education，Wuhan 430205，Hubei，China；2.Department of Female Tumor，Hubei Province Tumor Hospital，Wuhan 430079，Hubei，China）

The ultrasonic and ethanol immersion extraction process of flavonoids from stalks and leaves of Polygonum multiflorum thunb（FSLPMT）was optimized using the single factor experiment and orthogonal experiment.In addition，the anti-exercise-fatigue activity of FSLPMT was studied.The results showed that the optimum extraction condition of FSLPMT using ultrasonic and ethanol immersion extraction method was：ultrasonic extraction time 40min，volume fraction of ethanol 70%，liquid material ratio 1∶40（g/mL），and ultrasonic extraction temperature 80℃.Under the optimum conditions，the obtained rate of FSLPMT was 2.49%. The results of the treadmill test and weight-loaded swimming test showed that FSLPMT had a good resistance to movement fatigue.

stalks and leaves of Polygonum multiflorum thunb；flavonoids；ultrasonic ethanol extraction；orthogonal experiment；anti-exercise-fatigue

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.03.015

2016-09-13

钱小东（1983—），男（汉），讲师，硕士，研究方向：体育人文社会学。

*通信作者：黄伟（1987—），女（汉），医师，硕士，研究方向：妇科肿瘤。