上转换发光免疫层析法快速检测牛奶中雌二醇

姜会聪，任舒悦，王瑜，李巧凤，白家磊，彭媛，宁保安，孙思明，高志贤，，*

（1.郑州大学公共卫生学院，河南郑州450001；2.军事医学科学院卫生学环境医学研究所，天津市环境与食品安全风险监控技术重点实验室，天津300050）

上转换发光免疫层析法快速检测牛奶中雌二醇

姜会聪1，任舒悦2，王瑜2，李巧凤1，白家磊2，彭媛2，宁保安2，孙思明2，高志贤1，2，*

（1.郑州大学公共卫生学院，河南郑州450001；2.军事医学科学院卫生学环境医学研究所，天津市环境与食品安全风险监控技术重点实验室，天津300050）

建立定量快速检测雌二醇（E2）的上转换免疫层析技术。以上转换发光材料（UCP）为新型标记物，采用戊二醛法偶联单克隆抗体（mAb），制备UPT-mAb复合物，并以其作为探针，基于小分子竞争结合，建立免疫层析试纸条方法，并对试纸条性能进行评价。方法特异性强，稳定性好，灵敏度高，最低检出限低至2.75 ng/mL，线性范围为5 ng/mL～ 2 000 ng/mL，回收率88.88%～103.5%，变异系数CV＜10%。成功构建了上转换免疫层析法用于检测雌二醇，适用于现场快速检测，具有良好的经济价值和应用前景。

上转换发光材料；免疫层析；雌二醇；间接竞争

雌二醇（Estrodiol，E2）是一种天然的雌激素，也是一种典型的内分泌干扰物，在自然界广泛分布。雌二醇能够促进动物生长发育，提高动物的产奶量，因此被广泛用于肉鸡、猪、奶牛等禽畜饲养[1-2]。然而含有雌二醇的动物性食物可以通过食物链进入人体内并进一步富集，不仅能引起儿童性早熟，也可能会增加女性患乳腺癌的风险[3-4]。因此建立雌二醇残留的快速检测技术对保障人群健康具有重要意义。

传统的雌二醇检测方法主要是借助HPLC或GCMS等大型分析仪器[5-6]，可以准确灵敏的检测出样品中的雌二醇，但这些方法分析时间长，操作复杂。因此亟需建立一种快速简便的检测方法。

上转换发光材料（Up-Converting Phosphor，UCP）是一种由稀土元素掺杂的荧光纳米材料，能够将低能量的近红外光转化为高能量的可见光发射[7]。上转换发光材料表现出卓越的光学性能，比如高亮度，低毒性，低自发荧光背景等，在检测中可以不受背景荧光的干扰，具有高的灵敏度，近些年来，基于UCP的检测技术飞速发展，上转换发光技术（Up-converting phos phor technology，UPT）也应运而生[8]。免疫层析技术（Immunostrip assay，ICA）是一种建立在抗原与抗体特异性结合基础上的检测方法，该方法不仅快速，简便，灵敏度高，而且耗时短，适合于现场快速检测[9]。近年来基于上转换发光的免疫层析技术也得到了快速的发展，洪文艳等[10]将上转换材料与免疫层析技术相结合，用于检测鼠疫耶尔森菌LcrV抗体，刘海英[11]利用荧光免疫层析法检测牛奶中生物素的含量。本研究建立了雌二醇上转换发光免疫层析方法，并基于上转换发光免疫分析仪，用于奶制品中雌二醇残留的快速检测。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原材料与试剂

氯化钇（YCl3·6H2O）、氯化镱（YbCl3·6H2O）、氯化铒（ErCl3·6H2O）、1-十八烯（ODE）和油酸（OA）：山东西亚化学工业有限公司；3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）、四乙氧基硅烷（TEOS）和牛血清白蛋白（BSA）：Sigma公司；雌二醇（E2）、雌酮（E1）、雌三醇（E3）、己烯雌酚（DES）、己烷雌酚（HEX）：北京百灵威科技有限公司；雌二醇单克隆抗体（E2-ab）和雌二醇包被原（E2-BSA）：天津市环境与食品安全风险监控技术重点实验室自制；羊抗鼠抗体：北京索莱宝公司；玻璃纤维素膜、硝酸纤维素膜（NC膜）和PVC底板：北京热景生物技术有限公司；牛奶：天津联华超市；其它试剂均为分析纯。

1.1.2 仪器与设备

JEM-100CXII透射电子显微镜：日本电子株式会社；FTS6000傅里叶红外光谱仪：美国Bio-Rad公司；LGJ-10D型冷冻干燥机：北京四环科学仪器厂；HM3010单维往复划膜仪：上海金标公司；ZQ2000微电脑自动斩切机：上海金标公司；UPT-3A便携式上转换发光免疫分析仪：北京热景生物技术有限公司。

1.2 上转换免疫层析方法的建立

1.2.1 上转换颗粒的合成及修饰

取0.8mmol/LYCl3，0.18mmol/LYbCl3，0.02mmol/L ErCl3，加入盛有10mLOA和30mLODE的烧瓶中，加热搅拌升温至160℃，除去水和氧，保持30min后逐渐降温至50℃，加入20mLNaF溶液，50℃搅拌30min后升温至100℃并保持10min，然后在N2保护下快速升温至310℃并保持1 h。待反应体系降至室温，用环己烷洗涤沉淀三次，离心收集。

称取50mg颗粒于100mL圆底烧瓶中，加入30mL乙醇，1.25mL氨水，10mL水和30μL TEOS，40℃加热搅拌6 h后加入50μL APTES，40℃继续反应6 h；用乙醇洗涤沉淀3次，离心收集。

1.2.2 上转换颗粒标记抗体

10mg氨基化颗粒分散于5mL 0.01mol/LPBS中，加入1.5mL的戊二醛溶液，缓慢振荡2 h，离心分离后重悬于2mL去离子水中并加入20μL浓度为2.5mg/mL单抗，缓慢振荡2 h，加入BSA封闭后离心并弃上清，加入保存液和冻干液保存备用。

1.2.3 上转换发光材料结合垫处理与制备

将标记抗体的上转换颗粒溶液均匀滴涂在2 cm× 12.5 cm的玻璃纤维素膜上，冷冻干燥12 h，保存备用。

1.2.4 样品垫处理与制备

200mg S17加入到10mL Tris-HCl，均匀滴涂在2 cm×12.5 cm的玻璃纤维素膜上，烘干并保存备用。

1.2.5 NC膜处理与制备

将包被原与羊抗鼠抗体分别于NC膜的适当位置用划膜仪进行划线，烘干保存备用。

1.2.6 试纸条组装

在干燥环境中，将制备好的样品垫，结合垫，NC膜，吸水垫，依次黏贴于PVC板上，用自动斩切机切成4mm长的试纸条，组装上外壳，真空包装并保存备用。

1.2.7 试纸条工作参数的优化

为优化试纸条的最佳工艺参数，选择进样垫宽度，结合垫宽度，包被原浓度和羊抗鼠抗体浓度作为试验因素，采用四因素三水平正交试验确定试纸条的最佳制作工艺参数，具体试验设计见表1。

表1 上转换试纸条正交试验设计Table1 The orthogonal experimental design of UCP strip

1.3 上转换免疫层析试纸方法的评价

1.3.1 线性范围和最低检出限

将雌二醇依次稀释至不同浓度，在最优条件下组装好的试纸条间隔15 s依次加入不同浓度的雌二醇溶液，15min后，使用UPT-3A便携式上转换发光免疫分析仪检测，得到T/C值，每个测试重复测三组，按照公式（1）计算抑制率。

式中：T0和C0分别是空白样品检测线和质控线对应的相对荧光强度；T和C分别是不同浓度雌二醇小分子溶液对应的检测线和质控线对应的相对荧光强度。

1.3.2 稳定性

取同一批试纸条和三批不同PVC板的试纸条分别测5个浓度（2 000、500、125、31.25、7.812 5 ng/mL），重复3次，计算批内和批间的抑制率平均值（X）和标准差（S），按照公式（2）计算出变异系数。

1.3.3 特异性

将雌二醇（E2）、雌酮标（E1）、雌三醇标（E3）己烯雌酚（DES）和己烷雌酚（HEX）分别稀释至雌二醇抑制率为50%（IC50）时的浓度并检测。

1.3.4 加标回收

取5mL从超市买回来的牛奶，10℃离心10min除去上层脂肪层，将得到的样本用去离子水按照体积比1∶20稀释，过滤，得到待测溶液[12]。用待测溶液将雌二醇依次稀释至1 000、250 ng/mL和62.5 ng/mL，用试纸条检测，重复3次，求加标回收率。

2 结果与分析

2.1 检测原理

本方法设计原理是基于样品垫中E2与包被原（E2-BSA）竞争结合雌二醇单克隆抗体。样品中没有E2时，偶联有抗体的UCP颗粒（UCP-mAb）随液体在NC膜上流动时被检测线（T线）上的E2-BSA固定，T线相对于质控线（C线）会有很强的信号，即T/C越大。样品中有E2时，E2先和UCP-mAb结合，随液体流动到NC膜上的T线时，E2-BSA和E2竞争UCP-mAb，被竞争掉小分子的UCP-mAb在T线与E2-BSA结合，没有被竞争掉的小分子与UCP-mAb结合物随液体在NC膜上流动，并与C线上的二抗结合，小分子越多，C线的信号强度越大，T/C越小。

2.2 上转换颗粒的表征

本试验使用经典的溶剂热法合成上转换颗粒，所得产物的电镜图及红外表征图谱见图1。

结果显示，图1（A）中溶剂热法合成的上转换颗粒大小均一，粒径约为100 nm，图1（B）中，上转换颗粒修饰硅壳后，得到均匀的二氧化硅层，厚度约为7 nm，增加了在水溶液中分散性，有利于进一步检测。

图1 溶剂热法合成的上转换颗粒电镜图和红外图谱Fig.1 TEM images and infrared spectrums of UCNPs prepared by solvothermal method

图1（C-b）中，同时包覆硅壳和修饰氨基的上转换颗粒在1 091 cm-1处出现属于Si-O键的对称伸缩振动峰，在3 317 cm-1和1 635 cm-1处出现的特征吸收峰，分别属于氨基（-NH2）的伸缩振动和弯曲振动峰。该试验结果与文献中一致[13]。图1（C-c）中偶联抗体后在1 651 cm-1和1 535 cm-1左右出现了分别属于蛋白胺类的Ⅰ级和Ⅱ级特征吸收峰[14]。由此可见，上转换颗粒硅烷化后成功修饰上氨基，同时成功偶联抗体，可用于进一步检测。

2.3 上转换层析试纸条工作参数优化结果

本试验经全面考虑，最后确定加样垫宽度、结合垫宽度、包被原浓度和羊抗鼠浓度4个工作参数为本试验的试验因素，进行四因素正交试验，各因素均取3个水平，对工作参数进行优化，以每一组3次平行试验的半抑制率IC50的平均值IC50评价优化结果（当y=50时，表示50%的抗体被竞争结合时所对应的小分子浓度，记为半抑制率IC50），IC50越小，说明抗体对此竞争小分子的灵敏度越好。

通过比较A，B，C，D 4个因素中极值R的大小，得到具体分析数据如表2所示。

从表2中可得知A因素即加样垫宽度为最重要因素，然后依次为D羊抗鼠浓度、C因素包被原浓度和B因素结合垫宽度，即A＞D＞C＞B。由于A因素：k2＞k3＞k1；B因素：k3＞k1＞k2；C因素：k1＞k3＞k2；D因素：k2＞k3＞k1，所以产品的最佳配方组合为A1B2C2D1，即进样垫1.6 cm，结合垫0.9 cm，T线1.25mg/mL，C线0.8mg/mL。

表2 不同工艺参数的实验结果Table2 The results of different processing parameters

2.4 线性范围与最低检出限

本试验使用所制作试纸条检测雌二醇小分子，如图2所示。

图2 雌二醇检测标准曲线的绘制Fig.2 Standard curve for E2 detecting

所得S型曲线拟合度较好，得到标准曲线的线性方程为：Y=34.57X-20.89，R2=0.992 4，可知在5 ng/mL～ 2 000 ng/mL范围内，雌二醇浓度的对数值和抑制率呈良好的线性关系，最低检出限为2.75 ng/mL。

2.5 试纸条的稳定性评价

通过分别对同一批试纸条和三批不同批次的试纸条进行加样检测，测定结果见表3。

表3 批内和批间变异系数比较Table3 The coefficient of variation contrast within Intra-and inter-assay

由表3可知，批内和批间的变异系数均小于10%，说明不同批次试纸条之间和同一批试纸条内部的差异性不足以对检测结果造成明显的影响，由此可见该方法准确性好，精确度高。

2.6 特异性评价

试纸条的特异性直接关系到其进行定量检测的能力，因此特异性对评价上转换免疫层析方法具有十分重要的意义。本试验选取4种雌二醇类似物分别稀释至115.73 ng/mL，检测并计算出抑制率。

图3 不同种雌二醇类似物的抑制率Fig.3 The inhibition ratio for different compounds of E2

由图3可知，相对于雌二醇，其它小分子的抑制率均明显小于50%，由此可知本方法具有良好的专一性和选择性。

2.7 对实际样品的加标回收测试

用本方法制备的试纸条对市售的液态牛奶进行雌二醇含量加标检测，测定结果见表4。

表4 本方法对牛奶样品中雌二醇的加标回收率Table4 Recovery for the added E2from the milk samples obtained by the developed method

由表4可知，牛奶的加标回收率在88.88%～103.5%之间，说明本方法稳定，准确，灵敏，适合于牛奶实际样品中雌二醇的检测。

2.8 方法学评价

本方法与目前已经发表ELISA、胶体金等其它方法相比较，见表5。

表5 本方法与其它雌二醇检测方法的比较Table5 The comparison between this method and other detection methods of E2

表5中的比较结果表明上转换免疫层析方法同时兼具线性范围宽和检测限低的优势，具有良好的应用前景。

3 结论

本研究研制的上转换免疫层析试纸采用竞争结合的原理，以荧光稳定性和发光强度高的上转换材料为载体，结合方便快捷的免疫层析方法，构建了一种可用于现场快速定量检测牛奶中雌二醇的新技术。该检测方法不仅避免了被检物质背景光的干扰特异性强，稳定性好，同时具有灵敏度高和稳定性好的优点，最低检出限低至2.75 ng/mL，线性范围为5 ng/mL～ 2 000 ng/mL，变异系数CV＜10%，15min内即可以完成全部检测，适合于现场检测，与其它类似物相比，特异性很好，基本不受其它干扰物的影响。总之，本研究建立的上转换免疫层析试纸方法具有高的灵敏度，准确度，可靠性和稳定性，同时检测时间短，大大提高了检测效率，非常适合于现场检测，具有良好的经济价值和应用前景。

[1]NEBBIA C.Residui di farmaci e contaminanti ambientali nelle produzioni animali[M].Napoli:Edises,2008

[2]PEZZOLATO M,MAURELLA C,VARELLO K,et al.High sensitivity of a histological method in the detection of low-dosage illicit treatment with 17β-estradiol in male calves[J].Food control,2011, 22(10):1668-1673

[3]SALEHIF,TURNERM C,PHILLIPSK P,et al.Review of the Etiology of Breast Cancer with Special Attention to Organochlorines as Potential Endocrine Disruptors[J].Journal of Toxicology and Environmental Health,Part B,2008,11(3/4):276-300

[4]LANDAU-OSSONDO M,RABIA N,JOS-PELAGE J,et al.Why pesticides could be a common cause of prostate and breast cancers in the French Caribbean Island,Martinique.An overview on key mechanisms of pesticide-induced cancer[J].Biomedicine&Pharmacotherapy,2009,63(6):383-395

[5]LIZ,WANGS,ALICE LEEN,et al.Development of a solid-phase extraction-enzyme-linked immunosorbent assay method for the determination of estrone in water[J].Analytica Chimica Acta,2004, 503(2):171-177

[6]STOPFORTH A,BURGER B V,CROUCH AM,et al.The analysis of estrone and 17β-estradiol by stir bar sorptive extraction-thermal desorption-gas chromatography/mass spectrometry:Application to urine samples after oral administration of conjugated equine estrogens[J].Journal of Chromatography B,2007,856(1/2):156-164

[7]HAO S,CHEN G,YANG C.Sensing using rare-earth-doped upconversion nanoparticles[J].Theranostics,2013,3(5):331-345

[8]WANG F,LIU X.Recent advances in the chemistry of lanthanidedoped upconversion nanocrystals[J].Chemical Society Reviews,2009, 38(4):976-989

[9]汤轶伟,高子媛,魏立巧,等.标记免疫层析技术在食品安全检测中应用进展[J].食品安全质量检测学报,2014(7):1913-1917

[10]洪文艳,王浩然,王旺,等.检测鼠疫耶尔森菌LcrV抗体的上转换发光技术免疫层析试纸条的制备及应用[J].中华生物医学工程杂志,2012,18(1):54-57

[11]刘海英.荧光免疫层析检测牛奶中的生物素含量[J].食品研究与开发,2016,37(12):139-143

[12]WU S,DUAN N,M A X,et al.A highly sensitive fluorescence resonance energy transfer aptasensor for staphylococcal enterotoxin B detection based on exonuclease-catalyzed target recycling strategy [J].Analytica Chimica Acta,2013,782:59-66

[13]WANG M,HOU W,MI C-C,et al.Immunoassay of Goat Antihuman Immunoglobulin G Antibody Based on Luminescence Resonance Energy Transfer between Near-Infrared Responsive NaYF4:Yb,Er Upconversion Fluorescent Nanoparticles and Gold Nanoparticles[J]. Analytical Chemistry,2009,81(21):8783-8789

[14]DONG H,YAN F,JIH,et al.Quantum-Dot-Functionalized Poly (styrene-co-acrylic acid)Microbeads:Step-Wise Self-Assembly, Characterization,and Applications for Sub-femtomolar Electrochemical Detection of DNA Hybridization[J].Advanced Functional Materials,2010,20(7):1173-1179

[15]中华人民共和国农业部GB 29698-2013.食品安全国家标准奶及奶制品中17β-雌二醇、雌三醇、炔雌醇多残留的测定气相色谱-质谱法[S].北京:中国标准出版社,2013:1-7

[16]HUANG H,SHI S,GAO X,et al.A universal label-free fluorescent aptasensor based on Ru complex and quantum dots for adenosine, dopamine and 17β-estradiol detection[J].Biosensors and Bioelectronics,2016,79:198-204

[17]LIY,XU J,JIA M,et al.Colorimetric determination of 17 β-estradiol based on the specific recognition of aptamer and the salt-induced aggregation of gold nanoparticles[J].Materials Letters,2015,159: 221-224

[18]何方洋,万宇平,李静,等.雌二醇残留ELISA检测试剂盒的研制[J].畜牧与兽医,2011,43(8):60-62

[19]孙思明,周焕英,房彦军,等.雌二醇的免疫胶体金试纸法检测[J].中国公共卫生,2007,23(1):126-127

An Up-converting Phosphor Technology Based Immunostrip Assay for Rapid Detection of Estradiol in Milk

JIANG Hui-cong1，REN Shu-yue2，WANG Yu2，LI Qiao-feng1，BAI Jia-lei2，PENG Yuan2，NING Bao-an2，SUN Si-ming2，GAO Zhi-xian1，2，*
（1.College of Public Health，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001，Henan，China；2.Tianjin Key Laboratory of Risk Assessment and Control Technology for Environment and Food Safety，Institute of Health and Environmental Medicine，Military Medical Sciences，Tianjin 300050，China）

To develop an up-converting phosphor technology based immunostrip assay for quantitative detection of estradiol.A composition contained up-converting phosphor（UCP）as a novel lable and estradiol antibody（E2-mAb）with glutaraldehyde method.The estradiol was detected by the fluorescent immunostrip assay based on indirect competitive principle which had this composition asa probe.Detection performance including stability，specificity and sensitivity was evaluated.The method showed well stability，specificity and sensitivity with the detection limit of 2.75ng/mL，the linear range of 5 ng/mL to2000 ng/mL，the recovery of 88.88%to103.5%，and the coefficient of variation（CV）less than 10%.The established assay for E2detection can be successfully used to fast-field analysis and has good economic value and broad application prospect.

up-converting phosphor；immunostrip；estradiol；indirect competitive

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.03.026

2016-09-28

国家自然科学基金（21477162）；天津市科技支撑计划项目（14ZCZDSF00021）；天津市应用基础与前沿技术研究计划（15JCYBJC51200）

姜会聪（1990—），女（汉），在读硕士，从事营养与食品卫生学研究工作。

*通信作者