SPE-HPLC测定黄瓜、番茄中敌菌灵和异菌脲残留量

徐秋生，刘俊，贺慧琳，厉晨皓

（平湖市食品药品检测中心，浙江平湖314200）

SPE-HPLC测定黄瓜、番茄中敌菌灵和异菌脲残留量

徐秋生，刘俊，贺慧琳，厉晨皓

（平湖市食品药品检测中心，浙江平湖314200）

建立采用固相萃取-高效液相色谱法同时测定黄瓜、番茄中敌菌灵和异菌脲农药残留量的分析方法。样品用乙腈均质法提取盐析后脱水，经SPE固相萃取净化，浓缩仪浓缩后进液相色谱分离与检测，外标法定量。对样品进行添加回收率试验，添加浓度分别为0.1、0.5、1.0mg/kg，敌菌灵和异菌脲2种农药的回收率在82.5%～102.8%之间，标准偏差（RSD）在2.95%～8.68%之间，最低检出限为0.02mg/kg。该方法满足黄瓜、番茄中敌菌灵和异菌脲农药残留量的检测要求。

固相萃取；高效液相色谱；黄瓜；番茄；敌菌灵；异菌脲

敌菌灵（又称防霉灵），是由三聚氰酰氯与邻氯苯胺在脱酸剂存在下作用而得，化学名称2，4-二氯-6-（邻氯代胺基）均三氮苯，是一种杀菌谱较广的杂环类内吸性杀菌剂，常用于防治蔬菜灰霉病、菌核病、斑枯病、黑斑病、霜霉病、茭白胡麻叶斑病、瓜类炭疽病、黄瓜黑星病和番茄斑枯病等，具有低毒、内吸性、杀菌谱广等特点，广泛应用于粮食蔬菜等农作物[1]。异菌脲（又称扑海因），化学名称3-（3，5-二氯苯基）-1-异丙基氨基甲酰基乙内酰脲，是二甲酰亚胺类高效广谱、触杀型杀菌剂，对葡萄孢属、核盘菌属、小核菌属、链孢霉属均有较好抑菌活性，主要用于蔬菜灰霉病、番茄早疫病、苹果斑点落叶病和轮纹病的防治[2]。敌菌灵和异菌脲的结构式如图1、图2：

图1 敌菌灵结构式Fig.1 Structural formula of anilazine

图2 异菌脲结构式Fig.2 Structural formula of iprodione

农药在农业生产过程中无可避免的会被使用，这对人畜都有一定的毒副作用，对环境和生物链都有极大的破坏性，而水果、蔬菜上的农药残留问题也是由来已久的，已经对人体健康和生命安全造成了严重的威胁。目前农药残留限量标准，CAC、日本、欧盟和美国均有现行标准，规定了在水果、蔬菜和粮食中的最大残留限量值（MRL），并对其残留量进行监测。我国在2014年发布的最新版《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》[3]规定了387种农药在284种（类）食品中3650项限量指标，其中黄瓜、番茄中敌菌灵的最大残留限量值（MRL）均为10mg/kg，异菌脲的最大残留限量值（MRL）分别为2mg/kg和5mg/kg。

目前国内对于敌菌灵和异菌脲农药残留量的检测主要有气相色谱法、液相色谱法和气质联用法等[4-8]，前处理方法主要有液液萃取、固相萃取和基质分散固相萃取等。在比较和分析了上述几种检测敌菌灵和异菌脲农药残留量的检测方法参考文献后，本文采用了固相萃取-高效液相色谱法同时对黄瓜、番茄中敌菌灵和异菌脲农药残留量进行了研究，对不同的净化条件进行了比较，通过反复实验进行条件筛选，以提高方法的准确度和精密度，最终建立了一种简便可靠、可操作性强、准确度高的检测方法，可用于同时测定黄瓜、番茄中敌菌灵和异菌脲农药残留量。

1 材料与方法

1.1 仪器和设备

UltiMate 3000高效液相色谱仪（美国，Thermo Fisher公司）；TurboVapLV型全自动定量浓缩仪（瑞典，Biotage公司）；T25高速均质机（德国，IKA公司）；MS204S、PL602-L电子天平（瑞士，梅特勒-托利多公司）；LD4-2A离心机（北京医用离心机厂）；Milli-Q Advatantage A10超纯水机（法国，Merck Millipore公司）；KQ3200超声波清洗器（昆山市超声波仪器有限公司）；K600多功能食品粉碎机（德国，BRAUN公司）。

1.2 试剂和材料

敌菌灵、异菌脲农药标准品（纯度≥98.0%）：德国Dr.Ehrenstorfer；甲醇、乙腈、丙酮、正己烷（色谱纯）：德国Merck；氯化钠（分析纯）：国药集团；Cleanert Florisil柱（1000mg/6mL）：天津Agela；有机微孔滤膜（0.22μm）：天津Agela；超纯水：实验室（平湖市食品药品检测中心）自制。

1.3 样品处理

准确称取粉碎均匀的试样25 g（精确至0.01 g）于250mL广口瓶中，加入50.0mL乙腈，均质机高速均质2min，全部倒入100mL聚丙烯（PP）塑料离心管中，4 000 r/min离心5min，取上清液倒入预先称取5 g～7g氯化钠的100mL聚丙烯（PP）塑料离心管中，盖上塞子，剧烈振荡1min，静置30min，使乙腈相和水相充分分层。从离心管中吸取10.0mL乙腈溶液至15mL玻璃样品管中，置于全自动定量浓缩仪80℃水浴氮吹蒸发近干，加入2.0mL正己烷涡旋混匀待净化。依次用5.0mL正己烷+丙酮（90+10）淋洗液和5.0mL正己烷预淋洗Florisil（1 000mg/6mL）小柱，当正己烷液面层到达柱吸附层表面时，立即移入待净化样液，弃去上样流出液，用5.0mL正己烷+丙酮（90+10）淋洗液清洗样品管后淋洗小柱，并重复一次，用15mL玻璃样品管接收洗脱液。将盛有洗脱液样品管置于全自动定量浓缩仪上，水浴50℃氮吹蒸发近干，加入2.0mL甲醇涡旋混匀，过0.22μm有机微孔滤膜，上液相色谱测定。

1.4 色谱条件

色谱柱：AgilentZORBAXEclipseXDB-C18（250mm× 4.6mm，5μm）；流动相：A为乙腈，B为水梯度洗脱，梯度条件见表1；柱温：30℃；流速：1.0mL/min；检测器：二极管阵列（DAD）；紫外检测波长：218 nm；进样量：20μL。

表1 流动相梯度表Table1 Mobile phase gradient table

1.5 标准曲线的绘制

分别准确称取敌菌灵和异菌脲农药标准品，用甲醇定容作为标准贮备液。吸取敌菌灵和异菌脲农药标准贮备液适量，用甲醇稀释至浓度为0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0mg/L的系列标准工作溶液，上机测定，以标准工作溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程。

2 结果与讨论

2.1 检测波长的选择

取敌菌灵和异菌脲农药混合标准溶液，上机分析，在190 nm～400 nm范围内经二极管阵列（DAD）检测器扫描，发现敌菌灵在波长203 nm和262 nm处均有较强吸收，异菌脲在波长209 nm处吸收最大，波长高于250 nm几乎无吸收。由于在低波长处检测溶剂和杂质干扰较强，参考异菌脲的文献报道和标准方法[9-10]，综合考虑敌菌灵和异菌脲的特征波长，本方法统一采用218 nm为检测波长，在该波长下敌菌灵和异菌脲2种农药均有较好的吸收，并与样品杂质分离完全，不干扰样品中敌菌灵和异菌脲农药的测定。

2.2 淋洗液及用量的选择

取敌菌灵和异菌脲农药混合标准溶液适量于15 mL玻璃样品管中，置于全自动定量浓缩仪50℃水浴氮吹蒸发近干，加入2.0mL正己烷涡旋混合均匀，过预先活化好的Florisil柱（1 000mg/6mL），在重力作用下自然过柱，弃去正己烷流出液，当正己烷液面层到达柱吸附层表面时，分别用正己烷+丙酮（90+10）、正己烷+丙酮（85+15）和正己烷+丙酮（80+20）3种淋洗体系下各15mL淋洗液进行洗脱，分3管进行收集，每管收集5mL，50℃水浴氮吹蒸发近干，用2.0mL甲醇定容，进液相色谱分析后绘制3种淋洗体系下的淋洗柱形图，详见图3。

图3 不同淋洗条件下淋洗柱形图Fig.3 Elution column chart of different elution conditions

从图3中可以看出，10mL正己烷+丙酮（90+10）淋洗液可以把2种农药基本洗脱下来，5mL正己烷+丙酮（85+15）和正己烷+丙酮（80+20）淋洗液已完全把2种农药洗脱下来，但是相对正己烷+丙酮（90+10）淋洗液，后两种淋洗体系淋洗液的极性较强，容易洗脱出更多的色素和干扰杂质，所以本方法最终选择正己烷+丙酮（90+10）作为淋洗液，淋洗液体积10mL。

2.3 洗脱程序的优化

在流速为1.0mL/min条件下，分别选择流动相为乙腈+水（80+20）、乙腈+水（70+30）和乙腈+水（60+40）进行等度洗脱，取敌菌灵和异菌脲农药混合标准溶液上机分析。从色谱图中可以看出在乙腈+水（80+20）等度条件下，目标峰敌菌灵与溶剂峰有重叠，在乙腈+水（70+30）和乙腈+水（60+40）等度条件下，敌菌灵和异菌脲2种农药能完全分离，出峰时间分别在6min和9min以内，但目标峰敌菌灵附近有干扰杂质峰，影响最终检测结果。本方法选择了梯度洗脱程序，目标峰与杂质峰完全分离，敌菌灵和异菌脲农药标准溶液色谱图见4，出峰时间为敌菌灵（8.97min），异菌脲为（11.63min），分离度大于1.5。

图4 敌菌灵和异菌脲标准溶液色谱图Fig.4 Chromatogram of anilazine and iprodione standard solution

2.4 线性方程与检出限

在浓度为0.1mg/L～10.0mg/L范围内，敌菌灵和异菌脲2种农药标准溶液浓度与峰面积呈线性相关，线性关系良好，相关系数均大于0.999。线性方程分别为：Y=0.971 3X-0.001 4（r2=0.999 8）和Y=1.989 9X+0.131 5（r2=0.999 1），详见图5。

图5 敌菌灵和异菌脲标准工作曲线图Fig.5 The calibration curve of anilazine and iprodione

以3倍信噪比（S/N=3）为最低检出限，敌菌灵和异菌脲的检出限均为0.02mg/kg。

2.5 添加回收率与精密度

分别称取黄瓜和番茄空白基质样品25 g（精确至0.01 g），添加不同水平的敌菌灵和异菌脲农药标准溶液，按上述样品前处理方法进行样品提取与净化，液相色谱条件上机测定，每个添加浓度重复测定5次，计算添加回收率和相对标准偏差（RSD），结果见表2。

由表2可知，敌菌灵和异菌脲2种农药的添加回收率在82.5%～102.8%之间，RSD在2.95%～8.68%之间，表明该方法具有良好的精密度和准确度，符合农药残留分析要求。

表2 回收率与精密度试验（n=5）Table2 Recovery rate and precision test（n=5）

黄瓜空白样品色谱图和加标样品色谱见图6、图7，番茄空白样品色谱图和加标样品色谱见图8、图9。

图6 黄瓜空白样品色谱图Fig.6 Chromatogram of cucumber blank sample

图7 黄瓜加标样品色谱图Fig.7 Chromatogram of cucumber spiked sample

图8 番茄空白样品色谱图Fig.8 Chromatogram of tomato blank sample

图9 番茄加标样品色谱图Fig.9 Chromatogram of tomato spiked sample

从图6、图7、图8、图9中可以看出，在上述色谱条件下，色谱峰分离较好，无杂质干扰，能够满足日常快速检测黄瓜、番茄中敌菌灵和异菌脲农药残留量。

3 结论

建立了采用固相萃取-高效液相色谱法同时测定黄瓜、番茄中敌菌灵和异菌脲农药残留量的方法，并优化了试验条件。本方法敌菌灵和异菌脲2种农药的添加回收率在82.5%～102.8%之间，RSD在2.95%～8.68%之间，精密度和准确度都较高，操作简单快速、方法准确可靠，使用本方法完全可以满足黄瓜、番茄中敌菌灵和异菌脲农药残留量的日常检测需求。

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Determination of Anilazine and Iprodione Residues in Cucumber and Tomato by Solid Phase Extraction-high Performance Liquid Chromatography

XU Qiu-sheng，LIU Jun，HE Hui-lin，LI Chen-hao
（Pinghu Food and Drug Inspection Center，Pinghu 314200，Zhejiang，China）

To establish a solid phase extraction-high performance liquid chromatography（HPLC）method for simultaneous determination anilazine and iprodione pesticides residue analysis method in cucumber and tomato，the samples were extracted by acetonitrile homogenizing dehydration method，purified by solid phase extraction（SPE），while the concentrated liquid was separated and detected by liquid chromatography and quantified by external standard method.The added recovery experiments were also carried out in which the added concentration was 0.1，0.5，1.0mg/kg respectively，2 kinds of pesticides anilazine and iprodione rate of recovery was in the range of 82.5%to102.8%，the standard deviation（RSD）was in the range of 2.95% to 8.68%，the minimum detection limit of 0.02mg/kg.This method can meet the requirements of the determination for anilazine and iprodione pesticides residue in cucumber and tomato.

solid phase extraction；high performance liquid chromatography；cucumber；tomato；anilazine；iprodione

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.03.034

2016-05-20

徐秋生（1979—），男（汉），工程师，大学本科，研究方向：食品、农产品仪器分析与测试。