耐高温酒用酵母发酵生长条件的优化

魏春红，盛艳，吴泽柱

（1.黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江大庆163319；2.马利酵母有限责任公司，黑龙江哈尔滨150300）

耐高温酒用酵母发酵生长条件的优化

魏春红1，盛艳2，吴泽柱2

（1.黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江大庆163319；2.马利酵母有限责任公司，黑龙江哈尔滨150300）

对耐高温酵母生长条件进行优化研究。单因素试验结果表明：该菌种最适生长温度32℃，pH 6.0，搅拌转数750 r/min，接种量7.0%。在上述生长条件进行正交试验，优化结果：温度34℃，pH 5.0，搅拌转数800 r/min，接菌量5.0%，优化后OD560值为1.315。

耐高温；酒用酵母；生产条件

酵母菌广泛应用在酿造、发酵食品、石油代粮发酵、单细胞蛋白质、发酵饲料等工业。还可从酵母菌中提取医药、化工方面需要的一些重要原料，有广泛用途[1]。在自然界中，酵母菌多分布在含糖量高，偏酸性的环境中，是一种兼性厌氧性微生物，在有氧条件下好生长，大量繁殖。

酒用酵母是与人类关系最广泛的一种酵母，不仅因为传统上它用作酿酒，在现代分子和细胞生物学中用作真核模式生物，其作用相当于原核的模式生物大肠杆菌[2]。酒用酵母是发酵中最常用的生物种类。细胞为球形或者卵形，直径5μm～10μm[3]。酒用酵母是以糖蜜为原料，经过发酵通风培养的酿酒酵母、葡萄酵母、贝酵母等所制得的有发酵产酒能力的酿酒活性的酵母，其繁殖的方法为出芽生殖[4]。

在传统白酒发酵过程中，当通气充分时，酵母菌进行好氧呼吸，代谢能力强、速度快、菌体生长繁殖旺盛；在厌氧发酵阶段的厌气条件下，进行厌氧呼吸，经厌氧乙醇发酵代谢途径，发酵产生乙醇及相关发酵产物[5]。

在我国传统的白酒生产过程中，原粮糟存在淀粉利用不彻底的问题，如何提高原粮糟的淀粉利用率和降低能耗是困扰白酒行业的一个难题。酒用干酵母可有效提高原粮糟的淀粉利用率，提高出酒率，缩短发酵周期，可以弥补发酵力的不足，强化发酵，可净化微生物体系，保障生产，此外还具有耐高温、耐酒精、耐酸、耐浓糖、出酒率高等优点[6-7]。因此，分析酒用酵母的特性对白酒生产以及充分发挥其代谢发酵生产能力，提高白酒发酵原料利用率及白酒发酵生产率，具有重要的现实意义。

1 材料与方法

1.1 菌种

Y1359：由AB-Mauri公司GTG（Global Technology Group at Australia）研发机构提供。

1.2 材料与试剂

糖蜜：讷河红光糖厂采购甜菜蜜。

葡萄糖、蛋白胨、酵母浸膏：青岛海博生物科技有限公司；硫酸铵、硫酸镁、硫酸锌、磷酸一铵：天津北辰方正试剂厂；维生素B1、维生素B6：天津市志远试剂有限公司；生物素、泛酸钙：同泰唯润生物科技有限公司。

1.3 培养基

种子培养基（%）：葡萄糖0.1，蛋白胨0.5，酵母浸膏0.5，pH 7.0。

发酵培养基（%）：糖蜜5.0，硫酸铵0.3，磷酸一铵0.04，硫酸镁0.03，硫酸锌0.002，维生素B10.000 3，维生素B60.002，泛酸钙0.000 7，生物素0.000 1，pH 7.0。

1.3 仪器与设备

SpectrumLab752s紫外可见分光光度计：上海棱光技术有限公司；LDZX-25型立式压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；pHS-3C型精密pH计：上海精密科学仪器有限公司；HZQ-QX型恒温振荡器：中国哈尔滨东联仪器有限公司；BCN-1360生物洁净工作台：北京东联哈尔仪器有限公司；Cplus-10-3赛多利斯BioSTATA生物反应器：德国赛多利斯公司。

1.4 菌种活化

将Y1359斜面菌种转接到装有100mL种子培养基小三角瓶中，静置活化培养18 h。将活化菌种按5%的接种量加入1 000mL大三角瓶发酵培养基中。静置活化培养18 h。

1.5 淀粉出酒率的测定[8]

根据国标法GB/T 20886-2007《食用加工用酵母》检测耐高温酵母淀粉出酒率。

2 结果与分析

2.1 生长曲线的测定[8]

将活化的菌液按照5%接种量接于10 L生物发酵中，在pH 7、28℃、650 r/min条件下，每隔2 h测定培养液OD560值，根据OD560值绘制酵母菌生长曲线，见图1。

图1 酒用酵母生长曲线Fig.1 The growth curve of wine yeast

由图1可以看出，Y1359在10 h后进入对数生长期，25 h进入稳定期，36 h进入衰亡期。因此，可以选择对数生长期的中期作为后续试验中OD560值的测定时间，定为18 h。

2.2 温度对酵母产量的影响

按照5.0%的接种量接种已培养18 h的种子于pH 7.0的生物发酵罐中，不同温度（26、28、30、32、34、36、38℃）、650 r/min，培养18 h，测定发酵液的OD560值1.173，随着OD560值的增加，产量增加。温度对酵母产量的影响见图2。

图2 温度对酵母产量的影响Fig.2 Effect of the temperature on the result of yield

由图2可知，由于本菌种具有耐高温的特性，在适宜的温度32℃以外，过高或过低的温度对菌种的生长量都有影响。当温度低于32℃时，菌种活性降低，新陈代谢活动缓慢，呈休眠状态，菌种的生长量降低；当温度高于32℃时，菌种的对数期、稳定期缩短，衰亡期更早出现，使菌种的生长量降低。当温度过高时，菌种停止生长，甚至导致死亡，生长速率随温度升高而迅速下降。因此，菌种最适生长温度为32℃。

2.3 pH对酵母产量的影响

pH对菌种生长量的影响很大，不同微生物有不同的最适pH，对大多数菌种来说，菌种有保持其体内细胞酸质度在接近中性条件下的能力，这样有利于菌体进行正常的新陈代谢。

按照接种量5.0%接种已培养18 h的种子于不同pH（2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0）的生物发酵罐培养基中，30℃、650 r/min摇床培养18 h，测定发酵液的OD560值。pH对酵母产量的影响见图3。

图3 pH对酵母产量的影响Fig.3 Effect of the pH on the result of yield

由图3可知，pH为4.0时，菌种数量很少，随着pH的增加，菌种的数量逐步增加，在pH达到6.0时菌种数达到最高，OD560值为0.902，随后，pH值越大，越抑制菌种的生长，菌种数量开始逐渐下降。因此，菌种的最适pH为6.0。

2.4 搅拌转速对产量的影响

按照接种量5.0%接种已培养18 h的种子于pH 7.0的生物发酵罐中，30℃、不同搅拌转速（600、650、700、750、800、850、900 r/min）培养18 h，测定发酵液的OD560值。搅拌转速对产量的影响见图4。

图4 搅拌转速对酵母产量的影响Fig.4 Effect of the stir of revolution on the result of yield

由图4可知，随搅拌转速的增加，对培养基的通气量增加，菌体的生长量也会随着增加，在搅拌转数为750 r/min至900 r/min生长量较为接近。从生产成本考虑750 r/min为最适搅拌转速。

2.5 接种量对产量的影响

按照不同接种量（1.0%、3.0%、5.0%、7.0%、9.0%）接种已培养18 h的种子于pH 7.0的生物发酵罐培养基中，30℃、搅拌转速650 r/min培养18 h，测定发酵液的OD560值。接种量对产量的影响见图5。

图5 接种量对产量的影响Fig.5 Effect of the inoculation size on the result of yield

由图5可知，接种量以7.0%为宜。接种量过低时，菌种的数量也较低，对后期菌种的生长量有不利的影响；接种量过大，培养基营养成分消耗太快，有些初级代谢产物或次级代谢产物的产生对菌种的生长有抑制作用，曲线呈下降趋势。因此菌种的最适接种量为7.0%。

2.6 正交试验设计

为了进一步考察发酵条件对酵母产量的影响因素，进行四因素三水平的正交试验，因素水平见表1。

按照表1中数据进行正交试验。通过正交试验结果可以得出，极差R的大小顺序为A>B>D>C，即影响Y1359菌种生长主次关系依次是浸提温度>pH>接种量＞搅拌转速。酵母生长的最佳工艺条件为A3B1C3D1，即温度34℃，pH 5.0，搅拌转速800 r/min，接种量5%。在此条件下，Y1359OD560为1.315。

表1 因素水平表Table1 Factors and levels grap

表2 L9（34）正交试验表Table2 The L9（34）orthogonal test

表3 方差分析表Table3 The table of variance analysis

由表3方差分析结果可得出，温度、pH、各组因素间重复性差异极显著，接种量、摇床转速也达到了显著水平，说明试验数据是可信的。方差分析显示各因素对Y1359菌种生长均有影响。

2.7 淀粉出酒率

将活化的耐高温酒用酵母投入到液化、糖化的淀粉水解液中，经过40℃恒温发酵65 h，测的馏出液在20℃的酒精度为19.06%，出酒率为47%。

3 结论

在上述生长条件进行正交试验优化结果：最适温度34℃，pH 5.0，搅拌转速800 r/min，接菌量5.0%，优化后OD560为1.315。将活化的耐高温酒用酵母投入到液化、糖化的淀粉水解液中，经过40℃恒温发酵65 h，测的馏出液在20℃的酒精度为19.06%，出酒率为47%。

[1]吴士业,黄泽伟.酒用耐(嗜)酸酵母的诱变育种[J].中国酿造, 2010(8):124-126

[2]黄海,文成兵,李袁林,等.酒用酵母的分离及其特性研究[J].食品与发酵科技,2009(6):16-18

[3]于景芝,俞学锋.酵母生产与应用手册[M].北京:中国轻工业出版社,2008:32

[4]黄秀梨,辛明秀.微生物学实验指导[M].2版.北京:高等教育出版社,2008:76-78

[5]吴朝晖,胡道静.安琪耐高温酒精活性干酵母在名优酒中的应用综述[J].酿酒科技,1996(2):64-65

[6]俞学锋,李雪松,李志军.安琪耐高温酒用干酵母在中国的应用[J].酿酒,2002(2):57-59

[7]中华人民共和国国家质量技术监督检验总局,中国国家标准化管理委员会.GB/T 20886-2007食品加工用酵母[S].北京:中国标准出版社,2007

[8]钱存柔,黄仪秀.微生物学实验教程[M].北京:北京大学出版社, 1999:36-55

Optimization of Fermentation Growth Condition Medium for Thermostability Wine Yeasts

WEI Chun-hong1，SHENG Yan2，WU Ze-zhu2
（1.College of Food，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing163319，Heilongjiang，China；2.Harbin Mauri Yeast Co.，Ltd.，Harbin 150300，Heilongjiang，China）

The growth condition for thermostability wine yeasts was investigated in this research.The results of single factor experiments showed that optimum growth temperature was 32℃，pH was 6.0，stir of revolution was 750 r/min，inoculation was 7.0%.Optimum growth temperature was 34℃，pH was 5.0，stir of revolution was 800 r/min，inoculation was 5.0%，optimization OD560value of 1.315.

thermostability；wine yeasts；growth condition

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.03.037

2016-03-14

魏春红（1982—），女（汉），实验师，硕士研究生，研究方向：农产品精深加工。