动物源性产品中盐酸克伦特罗检测方法的研究进展

张瑞华，李芳，康怀彬，2，*，邹良亮，蔡超奇

（1.河南科技大学食品与生物工程学院，河南洛阳471023；2.食品生产与安全河南省协同创新中心，河南郑州450000）

动物源性产品中盐酸克伦特罗检测方法的研究进展

张瑞华1，李芳1，康怀彬1，2，*，邹良亮1，蔡超奇1

（1.河南科技大学食品与生物工程学院，河南洛阳471023；2.食品生产与安全河南省协同创新中心，河南郑州450000）

对盐酸克伦特罗检测方法进行了概述，比较了色谱法、免疫法与生物传感器分析法的区别，并讨论了最新检测方法的进展与方向，为今后在盐酸克伦特罗残留检测方法上提供新思路。

盐酸克伦特罗；检测方法；进展；新思路

盐酸克伦特罗（clenbuteerol hydrochloride，CLB），是一种肾上腺类神经兴奋剂，因其能促进脂肪分解、蛋白合成，又被称为“瘦肉精”。CLB结构中有多个可修饰位点，通过结合不同基团可以形成一系列类似物[1]。CLB极易被机体吸收，在动物组织中蓄积残留，且CLB性质稳定，一般的烹饪方法不能使其分解[2]。由此引发的中毒事件也不断发生，各国都采取了相应的法律法规监控在肉中的残留量。中国农业部的第235号公告修订了《动物性食品中兽药最高残留限量》规定CLB在所有动物性食品中不得检出[3]。因此，加强CLB残留监督监测十分必要。

由于CLB半衰期长，易蓄积在动物体内，其中大部分随尿液排出，少数残留在动物肝脏、肾脏、肌肉等部位[4]。目前文献[5-6]报道中常用固相萃取法处理肉样品，固相萃取技术具有操作简便、成本低、环保和可重复使用等优点，被广泛地应用于样品分离和浓缩过程中。此外，汤凯洁等[7]用分子印迹聚合物（MIPs）富集猪肝中的CLB用于高效液相色谱检测。王宛等[8]采用接枝中空纤维膜过滤去除样品中磷脂和蛋白质，用于液质联用的检测。由于样品基质复杂，要想达到较低的检测限要对样品作一系列的处理，这就相应的增加了成本。本文结合样品的处理方法对国内外检测方法进行了分析阐述，为CLB快速检测的研究提供参考。

1 色谱法

1.1 高效液相色谱法（HPLC）

HPLC检测方法多集中在类（多）残留检测以及和其他检测技术联用方面[9]。国标（GB/T5009.192-2003《动物性食品中克伦特罗残留量的测定》）中HPLC被作为半确证法。HPLC不仅要对色谱条件进行优化，样品的前处理方法也很关键。国标中样品前处理方法复杂，研究人员在此基础上进行改进，并未获取理想的效果。2015年朱晓艾等[10]分析比较了4种样品前处理的方法，并对色谱条件进行了优化，得到的线性范围为0.025μg/mL～0.400μg/mL，线性相关系数R2为0.999 6，回收率达88.55%～94.03%。研究发现对肉样的前处理只需液液提取、蛋白质沉淀两个过程，快速简单，且出峰时间短。因此适用于样品数量较多时复检，以快速检测出阳性或疑似阳性的样品。

1.2 气相色谱-质谱联用法（GC-MS）

GC-MS是目前较成熟的一种联用技术，它把色谱的高效快速分离和质谱高灵敏的定性分析结合起来，因此具有分离效果好、灵敏度高、既可定性又可以定量等优点。由于GC适用于有较低沸点和较高热稳定性的样品，而CLB的极性大沸点高，故测定前要对CLB衍生化。YiWen等[11]用GC-MS检测分析CLB残留之前，采用固相萃取/聚合物整体微萃取技术对猪肉样品进行处理，检出限为0.13μg/kg。GC-MS可以准确地对某种特定的残留物进行定性、定量分析，但是衍生化处理会造成实验偏差。

1.3 液相色谱-质谱联用法（HPLC-MS）

在检测复杂样品时，液相与质谱联用在一定程度上排除基质干扰，克服离子抑制现象，液质联用技术已成为迅速的分析方法之一。而HPLC-MS-MS联用时信噪比可进一步提高。陈海玲等[12]建立了HPLC-MS同时测定猪尿中CLB和莱克多巴胺的方法，采用MCX固相萃取柱萃取净化，并对质谱条件各参数进行优化，得到猪尿中克伦特罗和莱克多巴胺的检出限均为1.0μg/kg。此方法适合生猪宰杀前快速、有效监测。

色谱-质谱联用法能对CLB进行定性、定量测定，灵敏度较高，但此类方法需要对样品进行复杂的前处理（如采用气相色谱测定时，需要进行甲酯化衍生化反应），操作复杂，测试时间长、费用高，并且仪器昂贵、移动性差，难以推广普及。

2 免疫分析法

2.1 酶联免疫吸附分析法

酶联免疫分析法（ELISA）基本原理是竞争性抗原抗体特异性反应。研究人员可根据抗体产生机理设计合成针对一类药物的单克隆或多克隆抗体，实现对同一类药物的高通量检测。目前已广泛应用于临床和食品安全检测。因CLB在国外应用较早，其ELISA检测方法的研究也比国内早[13]。目前，欧盟、美国在CLB的宰前尿检、血检及屠宰现场检疫时都将其列为主要的筛选法。许春光等[14]用Randox公司产的ELISA检测试剂盒，结合ELX800通用酶标仪对442份生猪尿样进行检测，与GC-MS检测结果一致。但无法满足CLB残留痕量、超痕量检测的要求，所以ELISA一直作为大样本筛选的方法。

2.2 化学发光酶免疫分析法

1994年Rongen等[15]将化学发光标记应用于免疫分析，发现它的检测范围广、发光反应快、孵育时间短、价格低廉等优点，可适用于各种类型的免疫分析。化学发光酶免疫分析是化学发光法和酶免疫法结合的产物，同时具有高灵敏性和高特异性，近年来得到广泛应用。常用的酶是辣根过氧化物酶（HRP），而鲁米诺及其衍生物是最常用的酶促反应发光剂。用化学发光酶免疫法检测不同样品中CLB残留的相关文献报道如表1所示，对尿液采用间接夹心竞争免疫反应，对猪肉采用直接竞争免疫法，结果都能达到较低的检测限，且检测限差异不明显。

表1 不同类型的化学发光酶免疫法检测CLBTable1 Different types chemiluminescence enzyme immunoassay the detection of CLB

CLEIA与ELISA不同之处在于酶标记反应体系是化学发光反应。化学发光的优点是线性范围宽、灵敏度高、特异性强、自动化程度高、检测速度快、不受样本数量影响、试剂质量稳定。由于发光在瞬间完成，峰值出现的时间短，而且光背景高、成本相对较高。因此该法的应用受到一定的限制。

2.3 胶体金免疫技术

在碱性环境中，带负电荷的胶体金与带正电荷蛋白质分子基团通过吸附作用而形成牢固的结合，标记蛋白的生物活性并未受到影响。胶体金具有合成快速简单、大小均一、表面容易被硫基及其它生物基团修饰且生物相容性好等优点，近年来胶体金检测技术被广泛应用在食品安全监测中。2006年，G.P.Zhang等[19]用金标单克隆抗体制成层析式试纸条检测残留在尿液中CLB，检测限能达到1.0μg/mL，用特殊的模条扫描仪测定检测限可达0.1μg/mL。传统的胶体金免疫层析方法主要是通过肉眼观察检测线的有无来判断检测结果，对待测物进行定性或者半定量检测，检测结果易受温度、光线等环境因素和检测者的主观因素影响。基于胶体金光学读取仪的胶体金免疫层析快速定量检测方法具有速度快、操作简便、灵敏度高、可定量检测、数据可存储、适合现场快速筛查等优点[20]。

2.4 放射性免疫技术（RIA）

RIA是一种新型检测技术，它是对微生物受体进行标记，结合化学发光技术、生物发光技术和ELISA来进行检测的[21]。RIA检测方法具有特异性强、灵敏度高等特点。目前国外已经开发出应用该技术的试剂盒，此外还建立了用受体代替抗体结合CLB的分析法，此方法检测限可达到2.4 ng/g[22]。但该方法所用的仪器昂贵，对试验条件要求严格，且放射性同位素对工作人员有一定的伤害，不属于目前主要的分析方法。

3 生物传感器分析技术

生物传感分析技术是生物反应技术和传感技术有机结合的产物，该技术是当今世界上备受关注的综合高科技技术之一。其原理是用生物活性物质（如酶、抗体、抗原、细胞等）作为敏感基元，能对被测物进行高选择性地识别，配以适当的转换器，达到检测的目的。生物传感器因具有选择性好、响应速度快、样品用量少、操作简易、结构简单、体积小等优点。近年来成为科研工作者研究的热点。早在上世纪七十年代国外就有报道用免疫生物传感技术检测CLB[23]，国内生物传感器用于CLB检测起步较晚，目前还是处于实验室研究阶段。

2003年TRAYNORIM等[24]报道使用生物传感检测牛肝中多种β-兴奋剂。其中的CLB的检测限为0.11 ng/mL。回收率大于95%。2014年廉双秋[25]等将CLB-BSA作为传感芯片特异识别探针结合到生物芯片表面，通过溶液竞争法结合表面等离子体共振技术（SPR）检测CLB，检测限为1.03 ng/mL。

目前最有发展前景的是酶免疫传感技术分析法，酶免疫传感技术充分利用酶的化学放大作用，而且可以缩短检测时间。比传统的ELISA更灵敏、更简便。肖飞[26]等构建了双重信号放大的竞争型免疫传感器，构建的免疫传感器在0.01 ng/mL～100 ng/mL范围内有良好的线性关系，检测限达4.5 pg/mL。

4 其他分析方法

表面增强拉曼散射（SERS）标记方法结合了现代生物标记方法与SERS光谱方法。作为一种新颖的标记技术，它利用金或银等金属纳米粒子来增强拉曼信号，并将其作为标记示踪信号。基于SERS免疫标记原理，朱桂池[27]等研发出一种新的CLB检测方法，其主要原理如图1所示。

图1 SERS标记方法应用于CLB的检测原理图[27]Fig.1 Overview of SERS labeled method application in celenbuterol detection

首先使样品中游离的CLB和固定在固相基底表面的CLB完全抗原竞争性地与CLB抗体反应，其中CLB抗体和标记分子共同与金胶偶联。通过检测标记分子SERS信号强度的变化，达到检测CLB的目的。检测范围为0.1 pg/mL至100 pg/mL，其检测灵敏度最低可达0.1 ppt（pg/mL），比ELISA的检测限降低了至少两个数量级。

2016年，龚雨含等[28]采用光声光谱法进行测量，利用加权修正的方法建立了CLB光声光谱实时在线测量模型，分析了猪肉中水对其测量的干扰机制，为CLB测量仪的设计提供理论基础。设计了猪肉中CLB光声光谱检测试验系统，并验证了该方法可行性及快速性。

5 结论

本文综述了目前国内外检测盐酸克伦特罗的方法，发现利用自动化设备与仪器联接对样品进行前处理从而实现高效化、智能化是今后仪器检测的发展趋势。为了控制盐酸克伦特罗的残留，严格执法是基础，而有效的检测方法是技术保障。因此，研究开发更快速、高效、成本低的现场定性定量检测方法是未来检测盐酸克伦特的发展方向。

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Research Progress of Clenbuterol Hydrochloride Detection Method in Animal Products

ZHANG Rui-hua1，LI Fang1，KANG Huai-bin1，2，*，ZOU Liang-liang1，CAI Chao-qi1
（1.College of Food and Bioengineering，Henan University of Science and Technology，Luoyang 471023，Henan，China；2.Collaborative Innovation Center for Food Production and Safety，Henan Province，Zhengzhou 450000，Henan，China）

Clenbuterol hydrochloride detection methods were summarized.This paper compared the difference among chromatography，biosensor，immunoassay analysis and discussed the progress and direction of the detection method.It provided new ideas for the future on clenbuterol hydrochloride residue detection method.

clenbuterol hydrochloride；detection methods；progress；new ideas

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.03.047

2016-09-24

国家自然科学基金青年科学基金项目（31501563）；洛阳市畜牧局项目（2518）

张瑞华（1989—），女（汉），硕士研究生，研究方向：食品科学与工程。

*通信作者