扁桃体恶性肿瘤中microRNA-21和98的表达及临床意义*

王云，吴雪，李晶，柏青杨，赵治明

（1.齐齐哈尔医学院附属第二医院 耳鼻喉头颈外科，黑龙江 齐齐哈尔 161006；2.齐齐哈尔医学院 病理实验室，黑龙江 齐齐哈尔 161006）

临床研究·论著

扁桃体恶性肿瘤中microRNA-21和98的表达及临床意义*

王云1，吴雪1，李晶1，柏青杨2，赵治明1

（1.齐齐哈尔医学院附属第二医院 耳鼻喉头颈外科，黑龙江 齐齐哈尔 161006；2.齐齐哈尔医学院 病理实验室，黑龙江 齐齐哈尔 161006）

D O I：10.3969/j.i s s n.1005-8982.2017.03.011

目的初步探讨m i croR N A-21（m i R N A-21）和m i R N A-98在扁桃体恶性肿瘤的发生、发展及转移中的作用和临床意义。方法应用实时荧光定量聚合酶链反应检测53例扁桃体恶性肿瘤组织，50例扁桃体炎症组织及20例正常组织中m i R N A-21和m i R N A-98的表达水平，并分析其在不同临床病理指标下的表达。结果m i R N A-21在扁桃体恶性肿瘤组织中的表达量高于扁桃体炎症组织及正常组织，差异有统计学意义（P＜0.05）。恶性肿瘤组织中m i R N A-21的表达量与临床分期和淋巴结转移有关，与病理分级无关。m i R N A-98在扁桃体恶性肿瘤组织中的表达量低于扁桃体炎症组织及正常组织，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论扁桃体恶性肿瘤的发生、发展及转移可能与m i R N A-21和m i R N A-98的表达密切相关。

m i R N A-21；m i R N A-98；扁桃体恶性肿瘤；淋巴结转移

M i croRNA（m i RNA）是近年来倍受国内外学者关注的研究热点。其是一类普遍存在动植物体内的非编码小分子RNA，通过调节靶m RNA的降解或翻译抑制，从而对基因进行转录后表达调控，在恶性肿瘤的发生、发展过程中起着类似于癌基因或抑癌基因的作用[1-3]。随着肿瘤分子生物学的迅猛发展，许多恶性肿瘤的发生、发展被证实与m i RNA的表达异常有关，尤其头颈部恶性肿瘤组织中m i RNA拥有自己独特的表达特征、生物标记及其靶基因[4-6]，但m i RNA在扁桃体恶性肿瘤中的有关研究在国内尚未见报道。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2011年1月-2015年11月齐齐哈尔医学院附属第二医院53例扁桃体恶性肿瘤组织（其中41例为鳞状细胞癌，9例为淋巴肉瘤，3例为腺癌）、50例扁桃体炎症组织及20例咽部正常组织的石蜡标本。实验组及对照组病例临床资料完整，术前未接受放化疗和激素治疗。恶性肿瘤组织中男性49例，女性4例；年龄35～78岁，平均59岁。病理分级高分化例18，中分化例14，低分化例21。TNM分期（UICC2002）：Ⅰ期8例，Ⅱ期23例，Ⅲ期15例，Ⅳ期7例。实验组伴颈淋巴结转移者14例，无淋巴结转移者39例。

1.2 材料与试剂

试剂Tri zol（美国i nvi t rogen公司），焦碳酸二乙酯处理水（上海基尔顿生物科技有限公司），氯仿、异丙醇、无水乙醇、液氮、蒸馏水等（北京国药集团有限公司），SYBR Green聚合酶链反应（pol ym erase chai n react i on，PCR）试剂盒、逆转录试剂盒（美国Therm o公司），RNaseⅠ（立陶宛Ferm ent as公司），PCR引物（上海剑钝生物科技有限公司），Real-t i m e检测仪（美国ABI公司，型号：ABI-7300）。所有的试剂购回来后按说明书保存。RNA提取过程中所需的离心管、枪头等耗材经过0.1%焦碳酸二乙酯水浸泡过夜，121℃灭菌30 m i n，烘干后备用。

1.3 实验方法

总RNA提取和实时荧光定量PCR：严格按照分离试剂盒操作说明书提取扁桃体恶性肿瘤组织、扁桃体炎症组织及正常组织中总m i RNA。应用m i RNA逆转录试剂盒逆转录合成cDNA。应用m i RNA检测试剂盒定量检测分析不同组织中m i RNA-21和m i RNA-98的表达水平[7]。循环阈值（Ct）比较法分析各组织中m i RNA的相对表达量，以U6作为内参照。实验重复3次[8-9]。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 16.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组比较用t检验，多组比较用方差分析，数据满足正态性及方差齐性，两两比较用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 总RNA的质量和纯度

总RNA经2%琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外线下观察到3条带：2条明亮的带分别对应于28 S和18S RNA，暗一点的带则对应于5 S RNA。总RNA经过电子核酸分光光度计测定，OD260/OD280比值为1.8～2.0，表明所提取的总RNA样品较纯，而且没有降解，可用于m i RNA表达的检测。见图1。

图1 总RNA凝胶电泳

2.2 miRNA-21和miRNA-98在扁桃体恶性肿瘤的相对表达量

用特异引物对m i RNA-21和m i RNA-98进行扩增，同时以Let-7a作为内参，m i RNA-21、m i RNA-98和Let-7a的熔解曲线均为单峰曲线，产物单一，显示引物特异性比较好，无特异性扩增和引物二聚体干扰。见图2。

图2 miRNA-21、miRNA-98及Let-7a的熔解曲线

m i RNA-21、m i RNA-98及Let-7a扩增产物的扩增曲线中可见明显的对数扩增前期、对数扩增期和平台期，说明PCR产物丰富，引物敏感性较高。见图3。

图3 miRNA-21、miRNA-98及Let-7a的扩增曲线

3组m i RNA-21、m i RNA-98比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05），与正常组织和炎症组织比较，恶性肿瘤组织中m i RNA-21的表达量升高，而m i RNA-98降低。两两比较中，恶性肿瘤组织中m i RNA-21表达量与炎症组织比较，差异有统计学意义（t=48.481，P=0.000），恶性肿瘤组织中的m i RNA-21的表达量与正常组织比较，差异有统计学意义（t= 38.742，P=0.000）。炎症组织与正常组织m i RNA-21的表达量比较，差异有统计学意义（t=2.302，P= 0.023）。m i RNA-98在扁桃体恶性肿瘤组织中的表达量与扁桃体炎症组织、正常组织比较，差异有统计学意义。恶性肿瘤组织与炎症组织m i RNA-98比较，差异有统计学意义（t=38.978，P=0.000）。恶性肿瘤组织与正常组织m i RNA-98表达量比较，差异有统计学意义（t=27.791，P=0.000）。炎症组织与正常组织m i RNA-98表达量比较，差异无统计学意义（t=1.479，P=0.142）。见表1。

2.3 miRNA-21表达水平与临床病理特征的关系

m i RNA-21在扁桃体恶性肿瘤组织中呈高表达，其与患者的性别、年龄及肿瘤的病理分级比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；而与肿瘤的临床分期和淋巴结转移情况比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。恶性肿瘤组织中，临床分期Ⅲ、Ⅳ期m i RNA-21的表达量高于Ⅰ、Ⅱ期，颈淋巴结转移组m i RNA-21的表达量亦高于无淋巴结转移组。见表2。

表1 不同组织中miRNA-21和miRNA-98的相对表达水平 （±s）

表1 不同组织中miRNA-21和miRNA-98的相对表达水平 （±s）

注：†与恶性肿瘤组织比较，P＜0.05

组别m i RNA-98恶性肿瘤组织（n=53） 1.975±0.145 0.814±0.096炎症组织（n=50） 0.892±0.073† 1.914±0.182†正常组织（n=20） 0.823±0.099† 1.858±0.137†F值 1431.032 865.930 P值 0.000 0.000m i RNA-21

表2 临床病理特征与miRNA-21表达水平的关系

3 讨论

m i RNA对机体非常重要，机体需要用精密的调控系统来调节m i RNA。机体可以通过几个m i RNA的精细组合来调控某个特定基因的表达，也可以通过1个m i RNA的表达来调节多个基因的表达，从而使机体处于一个调节有序的状态。而m i RNA表达异常则可能会引起疾病包括恶性肿瘤的发生[10-12]。恶性肿瘤组织中的m i RNA也具有严格的组织特异性和时序性，多数肿瘤组织中异常表达的m i RNA同样能在外周血中检测到[13-14]，而且血清中的m i RNA能够耐受反复的冻融、酸碱，以及DNA酶的处理。这些特性表明，m i RNA可以作为理想的肿瘤生物学靶点，在临床上应用于肿瘤的诊断、预后评估及治疗[15-17]。本实验中，m i RNA-21和m i RNA-98在扁桃体恶性肿瘤组织、扁桃体炎症组织和正常组织中的表达量比较，差异有统计学意义。恶性肿瘤组织中m i RNA-21的表达量升高，临床分期中Ⅲ、Ⅳ期m i RNA-21的表达水平高于Ⅰ、Ⅱ期，颈淋巴结转移组m i RNA-21的表达水平高于非转移组，提示m i RNA-21的高表达可能与扁桃体恶性肿瘤的发生、侵袭及转移密切相关。而m i RNA-98在扁桃体恶性肿瘤组织的表达量与炎症组织和正常组织比较，差异有统计学意义，提示m i RNA-98可能在扁桃体恶性肿瘤的发生、发展中发挥抑癌基因的功能。实验初步证明，m i RNA-21和m i RNA-98参与扁桃体恶性肿瘤发生、侵袭及转移的调控，可能成为扁桃体恶性肿瘤侵袭转移的重要生物学标志。

综上所述，m i RNA的表达异常可能与扁桃体恶性肿瘤的发生、发展及转移相关，而临床上侵袭和转移正是判断扁桃体癌患者预后的重要指标[18]，因此对m i RNA进行深入、广泛的研究，了解扁桃体恶性肿瘤发生和转移的具体机制，可为临床设计合理可行的治疗方案，并可为恶性肿瘤转移的干预性治疗提供理论依据。

[1]PANJH A R,APUI J.M i cro-RNAs i n i nf l am m at ory di seases and as a l i nk bet ween i nf l am m at i on and cancer[J].Inf l am n Res, 2013,624：343-355.

[2]ADAM S B D,KASINSKI A L,SLACK F J.Aberrant regul at i on and f unct i on of m i croRNAs i n cancer[J].Curr Bi ol,2014,24：762-776.

[3]QIN Q,FURONG W,BAOSH ENG L.M ul t i pl e f unct i ons of hypoxi a-regul at ed m i R-201 i n cancer[J].J Exp Cl i n Cancer Res, 2014,33：50-54.

[4]GABRIELYG,W URDINGERT,KESARI S,et al.M i croRNA 21 prom ot es gl i om a i nvasi on by t arget i ng m at ri x m et al l oprot ei nase regul at ors[J].M ol Cel l Bi ol,2013,28：5369-5380.

[5]SANCH EZ-TILLO E,LIU Y,de BARRIOS O,et al.EM T-act ivat i ng t ranscri pt i on f act ors i n cancer：beyond EM T and t um or i nvasi veness[J].Cel l M ol Li f e Sci,2012,69：3429-3456.

[6]XIA H,H UI K M.M i croRNAs i nvol ved i n regul at i ng epi t hel i al-m esenchym al t ransi t i on and cancer st em cel l s as m ol ecul ar t arget s f or cancer t herapeut i cs[J].Cancer Gene Ther,2012,19： 723-730.

[7]H AN M,LIUM,W ANG Y,et al.Ant agoni sm of m i RNA-21 reverses epi t hel i al-m esenchym al t ransi t i on and cancer st em cel l phenot ype t hrough AKT/ERK1/2 i nact i vat i on by t arget i ng PTEN[J]. PLoS One,2012,7：DOI：10.1371/j ournal.pone.0039520.

[8]BRABLETZ T.EM T and M ET i n m et ast asi s：where are t he cancer st em cel l s[J].Cancer Cel l,2012,22：699-701.

[9]BAO B,W ANG Z,ALI S,et al.Not ch-1 i nduces epi t hel i al-m esenchym al t ransi t i on consi st ent wi t h cancer st em cel l phenot ype i n pancreat i c cancer cel l s[J].Cancer Let t,2011,307：26-36.

[10]BORNACH EA O,SANTOS M,M ARTINEZ-CRUZ A B,et al. EM T and i nduct i on of m i RNA-21 m edi at e m et ast asi s devel opm ent i n Trp53-def i ci ent t um ours[J].Sci Rep,2012,2：434-436.

[11]ZH ANG JG,W ANG JJ,ZH AO F,et al.M i croRNA-21(m i RNA-21)represses t um or suppressor PTEN and prom ot es growt h and i nvasi on i n non-sm al l cel l l ung cancer (NSCLC)[J].Cl i n Chi m Act a,2010,411：846-852.

[12]LIU L,JIANG Y,ZH ANG H,et al.m i R-22 f unct i ons as a m i cro-oncogene i n t ransf orm ed hum an bronchi al epi t hel i al cel l s i nduced by ant i-benzo[a]pyrene-7,8-di ol-9,10-epoxi de[J].Toxicol In Vi t ro,2010,24：1168-1175.

[13]KH URANA A,LIU P,M ELLONE P,et al.H Sul f-1 m odul at es FGF2-and hypoxi a-m edi at ed m i grat i on and i nvasi on of breast cancer cel l s[J].Cancer Res,2011,71：2152-2161.

[14]GRINSH PUN A,BEN-PORATH I,PERETZ T,et al.Tum or, m et ast asi s and what's i n bet ween[J].H aref uah,2013,152：30-33.

[15]GAO D,M ITTAL V.Tum or m i croenvi ronm ent regul at es epi t hel i al-m esenchym al t ransi t i ons i n m et ast asi s[J].Expert Rev Ant icancer Ther,2012,12：857-859.

[16]ALLEN M,LOUISE J J.The rol e of t he m i croenvi ronm ent on t he progressi on of cancer[J].J Pat hol,2011,223：162-176.

[17]ZH U S,W U H,W U F,et al.M i croRNA-21 t arget s t um or suppressor genes i n i nvasi on and m et ast asi s[J].Cel l Res,2008, 18：350-359.

[18]BRAUN J,H OANGVU C,DRALLE H,et al.Downregul at i on of m i croRNAs di rect s t he EM T and i nvasi ve pot ent i al of anapl ast i c t hyroi d carci nom as[J].Oncogene,2010,29：4237-4244.

（童颖丹 编辑）

Expressions of microRNA-21 and microRNA-98 in malignant tumors of tonsils and clinical significance*

Yun Wang1,Xue Wu1,Jing Li1,Qing-yang Bai2,Zhi-ming Zhao1
(1.Department of Otorhinolaryngoloy,the Second Affiliated Hospital of Qiqihar Medical College,Qiqihar,Heilongjiang 161006,China;2.Pathology Laboratory, Qiqihar Medical College,Qiqihar,Heilongjiang 161006,China)

ObjectiveTo investigate the role and clinical significance of the expressions of microRNA-21 (miRNA-21)and microRNA-98 (miRNA-98)in development and progression of malignant tonsilar tumors.MethodsThe expressions of miRNA-21 and miRNA-98 were detected by qRT-PCR in the 53 specimens of tonsilar neoplasms and 50 specimens of inflammatory tonsilar tissues and 20 specimens of normal muscosa. The expressions of miRNA-21 and miRNA-98 in the tonsilar neoplasms were analyzed with different clinicopathological parameters.ResultsThe expression of miRNA-21 in the malignant tonsilar tumors was significantly higher than that in the inflammatory tonsilar tissues and normal muscosa (P＜0.05).There were positive correlations between miRNA-21 expression and both TNM staging and lymph node metastasis;but not pathological grade.The expression of miRNA-98 in the malignant tonsilar neoplasms was significantly lower than that in the inflammatory tonsilar tissues and normal muscosa (P＜0.05).ConclusionsThe expressions of miRNA-21 and miRNA-98 may be correlated with the development and progression of malignant tonsilar neoplasms.

miRNA-21;miRNA-98;malignant tonsilar neoplasm;lymph node metastasis

1005-8982（2017）03-0055-04

R 739.64

A

2016-03-28

齐齐哈尔医学院科研基金（No：QY2015L-06）

赵治明，E-m ai l：yuenhao2001@163.com；Tel：18646632303