小鼠肝组织DNA的提取及鉴定综合性实验在生物化学与分子生物学教学中的实施

丁 航，李彩虹，马卫列，张志珍

（广东医科大学，广东 东莞 528000）

小鼠肝组织DNA的提取及鉴定综合性实验在生物化学与分子生物学教学中的实施

丁 航，李彩虹，马卫列，张志珍*

（广东医科大学，广东 东莞 528000）

生物化学与分子生物学是医学专业重要的基础课程，实验教学尤其是综合性实验教学对学生综合技能的培养至关重要。从实验设计思路、组织实施、实施效果、教学体会等方面阐述小鼠肝组织DNA的提取及鉴定综合性实验在生物化学与分子生物学教学中的实施，并分析教学中存在的问题，提出相应的对策，为有关院校进行相关的综合性实验教学提供参考。

小鼠肝组织DNA；综合性实验；生物化学与分子生物学

生物化学与分子生物学是基础医学与临床医学密切联系的学科，实验课是其教学的重要组成部分，是提高学生基本实验操作技能的主要手段，是培养学生独立分析问题、解决问题能力的重要教学途径之一，是学生后续专业技能学习与提高的必要基础。为了帮助学生更好地理解生物化学与分子生物学的理论知识，通过开展小鼠肝组织DNA的提取及鉴定综合性实验，帮助学生克服对生物化学与分子生物学的抽象、畏难情绪，认识到生物化学与分子生物学不再神秘，可以自如驾驭[1]。这样不仅利于提高生物化学与分子生物学的教学质量，而且能锻炼学生综合技能的运用能力。

1 实验设计原理

真核细胞中，DNA以核蛋白形式存在于细胞核中。提取质量较好的DNA产品应该遵循两个基本原则：一是要将DNA与蛋白质、脂类、糖类和RNA等充分分离；二是在操作过程中尽量避免DNA断裂，保持其分子的完整性。

在各种动物组织DNA提取方法中，最常用的经典方法是酚/氯仿抽提法。本实验在小鼠肝组织DNA抽提过程中加入十二烷基硫酸钠（Sodium Dodecyl Sulphate，SDS），可破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与DNA分子分离；加入乙二胺四乙酸（Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，EDTA），可抑制脱氧核糖核酸酶活性，减少DNA分子降解。释放出来的DNA用酚/氯仿抽提，除去蛋白质，然后用氯仿抽提，以除去DNA溶液中微量酚的污染，最后用无水乙醇使DNA沉淀析出，得到目的产物。

DNA的特征吸收峰位于260 nm处，测定出A260nm数值后，利用公式可推算出不同形式DNA样品的浓度。分离提取DNA时主要的杂质之一是蛋白质，其特征吸收峰位于280 nm，同时测定出DNA样品的A260nm值及A280nm值后，计算出A260nm/A280nm的值，大致可以判定产品的组成情况。

2 实验课程的内容

2.1 肝匀浆的制备

断颈法处死小鼠，立即取出肝脏，用冷生理盐水洗去表面附着的血液，滤纸吸干多余水分，稍剪碎，放入玻璃匀浆器中，加入10 mL冷TE缓冲液，一手持匀浆管将下端插入待匀浆样品中，另一手将捣管垂直插入套管中，上下转动研磨数十次（6～8分钟），充分研碎，得到组织匀浆液。

2.2 提取DNA

（1）取0.2 mL匀浆液置于1.5 mL离心管中，加入10%SDS溶液0.2 mL，颠倒混匀，室温放置5分钟，溶液变黏稠。（2）取饱和酚0.25 mL，氯仿/异戊醇0.25 mL，加入上述溶液中，颠倒混匀，室温放置5分钟（其间不断摇动离心管以保持溶液呈乳状），在4℃以12 000 r/min离心10分钟。（3）取出离心管，小心吸取上层溶液，将其置入一支新的1.5 mL离心管中，加入0.5 mL氯仿/异戊醇，颠倒混匀，室温放置5分钟，在4℃以12 000 r/min离心5分钟。（4）取出离心管，小心吸取上层溶液（记住溶液体积，可分多次吸取，避免吸到沉淀部分），将其置入一支新的1.5 mL离心管中。加入0.3倍上清液体积的10 mol/L NH4Ac溶液及2.5倍上清液体积的无水乙醇后，颠倒混匀，即可观察到纤维状DNA沉淀析出。在4℃以12 000 r/min离心5分钟，小心倒去上层溶液，将离心管甩干，静置5分钟使乙醇挥发。加入1.0 mL TE缓冲液溶解DNA。

2.3 DNA的测定

将溶解的DNA样品转移到干净试管中，加入3.0 mL TE缓冲液，混匀。以TE缓冲液为空白溶液调零，在紫外分光光度计上分别测定DNA溶液的A260nm值和A280nm值。

3 实施的效果

3.1 巩固并拓展了所学知识，熟悉了实验基本原理和操作过程

由于生物化学与分子生物学这门课程的理论知识较为抽象，复杂难懂，学生在预习实验的过程中，需要查阅书本，上网观看课程实验视频或者在网上查找资料，以便更好地整理、融合、消化、理解实验原理、操作步骤和注意事项等，使生物化学的理论得到更加形象的验证。同时，帮助学生更清晰地认识和更好地掌握这个实验所涉及的知识点。这正是每个综合性实验所要达到的目的。

3.2 调动了学生学习的积极性和主动性

本综合性实验改变了传统的“实验课教师讲学生听，学生再按照实验指导机械地完成实验操作”的模式，这次实验课前，教师已要求学生预习实验，要对实验目的、操作程序和要求有所了解，查阅资料，开拓思路，带着问题在实验课上动手操作[2]。在实验过程中或在实验结束后的专题实验报告中，学生可以随时提出自己对实验过程设计的想法。如此安排，对于调动学生学习的积极性和主动性很有帮助。在实验中环环相扣，往往上一个小实验的结果就是下一个小实验开始的前提，肝组织的研磨必须充分，这样才能得到较高纯度的DNA，进而进行后续实验。这种实验安排促使学生必须认真仔细地对待每一步操作，以获得准确的实验结果。若没有获得理想的结果，就要自己查找原因，促使学生成为整个实验教学的主体。

3.3 加强了学生动手能力

在以前传统的实验教学模式中，学生根据讲义上所写的实验步骤和教师课堂讲解进行机械性操作，操作较为简单[3]。就本次综合性实验而言，从杀鼠取肝、研磨、提取DNA到DNA含量测定，学生都需要格外小心，要全神贯注地操作，稍不注意就有可能导致实验失败，在此过程中，大大提高了学生的动手能力。

3.4 增强了团队意识

随着现代科技的飞速发展，科学研究越来越重视团队合作，单靠一个人的力量很难事事通晓、面面俱到，因此，教师应该有意识地培养学生与他人合作、交流、沟通的能力。在本次综合性实验中，几乎每一步都需要学生互相合作，这是实验成功的关键。因此，本实验有效地增强了学生的团队意识。

DNA的提取是生物化学与分子生物学研究的基础技术，提取的DNA的纯度及结构完整性是进行基因工程各项研究所必需的条件。目前应用较为广泛的有亲子鉴定、法医鉴定、基因重组及疾病检测等。另外，在基因工程研究中，常常需要提取分离基因组DNA，可用于构建基因组文库、Southern杂交及PCR分离基因等。通过本实验，可以使学生对DNA的提取有所了解、对DNA的提取研究有一个整体概念，从而提高学生的综合能力，使他们所学知识更完整并得到升华。

[1]王宁，陈园园，李仲，等.浅谈医学生物化学实验教学的改革与探索[J].教育教学论坛，2016（28）：272-273.

[2]徐宋瑶，薛昕，邓凤，等.医药类院校生物化学实验教学改革的探索与研究[J].继续医学教育，2017，31（2）：20-21.

[3]王辉.病原生物学与免疫学实验课教学改革及实践[J].科技文汇，2016（11）：77-78.

G424．31

B

1671－1246（2017）22－0074－02

广东医科大学教学质量与教学改革工程项目（JG1403）

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张志珍）