江西省水痘-带状疱疹病毒基因特征研究

周 珺，熊 英，龚 甜，李健雄

(江西省疾病预防控制中心，江西南昌330029)

江西省水痘-带状疱疹病毒基因特征研究

周 珺，熊 英，龚 甜，李健雄

(江西省疾病预防控制中心，江西南昌330029)

目的了解江西省2010至2013年流行的水痘-带状疱疹病毒的基因型别。方法选取2010年至2013年南昌市的水痘-带状疱疹临床诊断病例，采集疱疹液和（或）咽拭子标本，提取水痘病毒DNA，对病毒基因组的ORF22区及ORF68区进行扩增、测序和分析，将测序结果与GeneBank的VZV参考株的基因序列进行比较。结果采集到的84份标本中共有55份检测到水痘-带状疱疹病毒核酸；ORF22区的测序结果经与水痘带状疱疹病毒J基因型的代表株p-Oka株及水痘疫苗代表株v-Oka株的基因序列进行对比，发现6个关键位点完全相同；对ORF68区的测序结果进行比对并未发现任何突变。结论江西省2010-2013年流行性的水痘-带状疱疹病毒均为J基因型。

水痘－带状疱疹病毒（VZV)；测序；基因型

水痘-带状疱疹病毒(Varicella-Zoster Virus，VZV)是引起常见疾病水痘及带状疱疹的病原体，初次感染人体可引起水痘，而后可以长期潜伏在人体内，当机体免疫力下降时，病毒会再度感染人体，形成带状疱疹。此外，水痘是一种常见的儿童呼吸道传染病，每年在全世界引起大量的儿童发病。

VZV是一种DNA病毒，全基因组共12.5万个碱基，71个开放读码框(Open Reading Frame，ORF)，编码80个蛋白质。VZV只有一个血清型[1]，但不同毒株之间在基因序列上存在差异。近年来从基因水平上来探讨不同VZV毒株之间的差异并通过基因序列分析来对病毒进行分型成为国际上VZV研究的热点[2]。本研究将选取水痘-带状疱疹病毒基因组中的ORF22及ORF68区进行基因扩增及序列分析，通过与水痘-带状疱疹病毒的几种基因型代表株对应区域的序列进行比对，确定我省近几年流行的水痘-带状疱疹的主要基因型。

1 材料与方法

1.1 标本来源从2010年至2013年，在江西省儿童医院及南昌市高新区医院选择临床诊断为水痘或带状疱疹的病人采集疱疹液和（或）咽拭子标本，共84份，所有标本采集后均置于-70℃冷冻保存。

1.2 实验方法

1.2.1 主要试剂与仪器主要试剂：DNA提取试剂盒QIAmp DNA Mini kit（德国Qiagen公司，51306），DNA扩增试剂盒GoTaq Green Master Mix (Promega公司，0000031171），水痘病毒减毒活疫苗（长春祈健生物制品有限公司，201301008），琼脂糖（上海生工，AB0016H-250G），GOLD VIEW染料（Solarbio，G8140）。

主要仪器设备：PCR扩增仪PTC-200（美国Bio-Rad），凝胶电泳仪（北京六一），全自动凝胶成像仪（VILBER LOURMAT）。

1.2.2 PCR扩增按照QIAmp DNA Mini kit试剂盒的说明书操作对原始标本提取病毒核酸，使用特异性引物扩增病毒基因组的ORF22及ORF68区，引物序列：ORF22区引物F：GGGTTTTGTATGAGCGT TGG，R：CCCCCGAGGTTCGTAATATC[3]；ORF68区引物F：AGAACGCACACGAACACCAT，R：TCCGCT TCCTTCTTACCTTG[4]。扩增体系按扩增试剂盒试剂说明书操作；扩增反应条件为：95℃5min，94℃30s，55℃30s，72℃1min，共35个循环，最后72℃10min。取水痘疫苗以同样的方法进行PCR扩增，作为对照。取扩增产物8μl，1.5%琼脂糖凝胶在120V电泳30min，在自动凝胶成像仪上观察结果。

1.2.3 产物序列测定和分析对扩增产物进行序列测定（由上海生工公司完成）。核苷酸序列采用DNAStar5.0、Mega5.2序列分析软件进行分析；与在GenBank中收录的E基因型代表株欧洲水痘代表株Dumas株（GenBank NO.X04370），J基因型代表株日本流行株p-Oka株（GenBank NO.AB097933）、疫苗推荐代表株v-Oka株（GenBank NO. AB097932）及M2基因型代表株DR株（GenBank NO.DQ452050）的序列进行比对。

图2 21份标本中病毒与各基因型代表株核苷酸序列比较示意图

2 结果

2.1 原始标本检测结果所有84份原始标本经ORF22区引物扩增（扩增产物大小约为447bp）琼脂糖凝胶电泳后共检测到55份阳性；ORF68区引物（扩增产物大小约为498bp）的检测结果与ORF22区引物的检测结果完全相同。

2.3 序列分析结果ORF22区测序比对结果：对所有扩增阳性的产物进行测序，但因为有些产物浓度不够，最后得到21份不同标本中病毒ORF22区的部分核苷酸序列。参考株J基因型p-Oka株及v-Oka株在37902、38019、38055、38081、38177、38229这6个位点的碱基分别为G、G、C、C、A、A，而这21份标本在这6个位点的碱基与参考株完全一致（见图2黑框处），说明这21份标本中的病毒皆为J基因型。

ORF68区测序比对结果：对所有扩增阳性的产物进行测序，但因为有些产物浓度不够，最后得到24份不同标本中病毒ORF68区的部分核苷酸序列。所测得的24个ORF68部分区域的核苷酸序列与Dumas株和Oka株序列完全一致，即表明这些VZV的糖蛋白E未发现类似北美2MSP株或2BC株的碱基突变。

3 讨论

水痘-带状疱疹病毒（Varicella-Zoster Virus，VZV），又称3型人类疱疹病毒，是水痘及带状疱疹的病原体，在初次感染人体时症状通常表现为皮肤上出现含有液体的疱疹即为水痘，而病毒在原发感染后能潜伏在宿主的感觉神经节内，当机体免疫力降低时病毒可再次激活可以引起疼痛性的皮肤疾病即带状疱疹[5]。

VZV的基因组为DNA，有12.5万个碱基，但只有一个血清型。近年来，国际上多通过对病毒的基因序列进行分析来对病毒进行基因分型。经过许多科学家的研究，发现VZV的基因组中有许多SNP位点，通过不同的排列组合，可以将VZV分为若干个基因型。SNP即单核苷酸多态性（Single nucleotide Polymorphism，SNP），而SNP位点是指基因组DNA中因为单个核苷酸变异引起的DNA序列的改变，包括转换、插入、缺失等多种形式，但这种单个核苷酸变异在群体中发生的频率要大于1%时才能被认为是SNP[6]，以免一些罕见的基因突变被认为是SNP。在以往的研究中已经从VZV基因组中发现了至少58个SNP位点[7]。Loparev VN等[8，9]在对病毒ORF22区的基因进行测序分析后发现病毒基因组中的ORF22区在37837-38283位点之间有6个点可准确的将病毒分为E、J、M1和M2等几个基因型。这6个位点分别为37902、38019、38055、38081、38177和38229；其中E基因型在这6个位点的碱基依次为A、G、T、A、G、A，代表株为Dumas株；J基因型在这6个位点则依次为G、G、C、C、A、A，代表株为p-Oka株；M1基因型在这6个位点依次为A、G、T、C、G、A，代表株为CA123株；M2基因型则又分为3个亚型，也是依据这6个位点的碱基不同而进行分型。

本研究所采集的标本经在ORF22特定区域进行PCR扩增及测序并与参考株进行比对分析后发现：本次研究所采集的标本中的VZV病毒均为J基因型。因水痘-带状疱疹病例的临床症状较典型，需要进行实验室病原学确诊率的几率低，且目前未被列入我国的法定报告传染病，故此我国的VZV研究较少，各地流行的基因型也不太明确。在笔者查到的文献中，有Loparev VN等[8]2004年从中国的南方(广东等地)收集的3份标本中的病毒为M基因型，从中国北方(山东等地)收集的3份标本中的病毒为E基因型；杨吉星等[10]2008年收集的上海地区1份标本及李崇山[4]等2009年收集的3份标本中病毒的基因型均为J基因型；周小勇等[11]2009年收集的武汉地区78株VZV基因型也为J基因型；马睿等[12]2009-2010年收集的宁波地区15份标本中有13株VZV为J基因型，另2株为M1基因型；王艳等[13]2012年在辽宁省收集到的3份临床标本中的病毒均为J基因型；陈婷婷等[14]在福建省2011-2012年收集的44份VZV毒株也均为J基因型；甘霖等[15]在合肥地区收集的44株毒株也均为J基因型。本研究首次在江西省连续收集水痘的临床标本对其中的病毒进行基因分析，发现近几年在江西省流行的VZV也都为J基因型。综合文献查阅的结果可见，我国近年来大部分地区流行的VZV基本都为J基因型，可能也有E和M基因型的流行。此外，曾有研究通过对ORF68区域的测序结果发现北美株2MSP和2BC中有点突变[4]，而本研究没有发现类似的该突变。要充分掌握我国VZV的流行趋势及分子进化方向，有待更多的研究者在全国更为广泛的地区收集更多的标本，进行持续而更加全面的研究。

[1]许松涛.水痘[J].中国疫苗和免疫，2009，15(1)：78-82.

[2]Quinlivan M，Breuer J.Molecular studies of varifcella-zoster virus [J].Rev Med Virol，2006，16(4)：225-250.

[3]Loparev VN，A rgaw T，Krause PR，et al.Improved identification and differentiation of varicella-zoster virus(VZV)wild-type strains and an attenuated varicella vaccine strain using a VZV open reading frame 62 based PCR[J].J Clin Microbiol，2000，38（9）：3156-3160.

[4]李崇山，鲁礼瑞，陆菁，等.水痘-带状疱疹病毒基因特征分析[J].疾病监测，2009，24(3)：168-171.

[5]江龙凤，甘霖，陈敬贤，等.水痘－带状疱疹病毒的基因分型与分子进化[J].病毒学报，2012，28(5)：584-590.

[6]Kruglyak L.The use of a genetic map of biallelic markers in linkage studies[J].Nat Genet，1997，17(1)：21-24.

[7]Sengupta N，Taha Y，Scott FT，et al.Varicella-zoster virus genotypes in East London：aprospective study in patients with herpes zoster[J].J Infect Dis，2007，196(7)：1014-1020.

[8]Loparev VN，Gonzalez A，Deleon-Carnes M，et al.Global indentification of three major genotypes of varicella-zoster virus：longitudinal clustering and strategies for genotyping[J].J Virol，2004，78 (15)：8349-8358.

[9]Loparev VN，Rubtcova EN，Bostik V，et al.Identification of five major and two minor genotypes of varicella-zoster virus strains：apractical two amplicon approach used to genotype clinical isolates in Austalia and New Zealand[J].J Virol，2007，81(23)：12758-12765.

[10]杨吉星，居丽雯，施强.上海地区水痘带状疱疹病毒基因型研究[J].中国卫生检验杂志，2008，18(2)：223-224.

[11]周小勇，曾志良，冯永芳.武汉地区水痘带状疱疹病毒基因型分析[J].中华皮肤科杂志，2009，42(10)：688-690.

[12]马瑞，许国章，李翔，等.宁波市水痘-带状疱疹病毒流行株基因分型[J].中国公共卫生，2012，28(5)：659-660.

[13]王艳，马艳，韩悦，等.辽宁省水痘-带状疱疹病毒基因型分析[J].中国公共卫生，2012，28(1)：76-78.

[14]陈婷婷.福建地区水痘-带状疱疹病毒临床分离株基因型分析[M].福州：福建医科大学，2012.

[15]甘霖.水痘-带状疱疹病毒临床分离株基因特征分析[M].合肥：安徽医科大学，2010.

Varicella Zoster Virus Gene Characteristics of Jiangxi province

ZHOU Jun，XIONG Ying，GONG Tian，LI Jianxiong.Center for Disease Control and Prevention of Jiangxi Province，Nanchang 330029，China.

Objective To understand the genotype of varicella zoster virus(VZV)in Jiangxi province from 2010 to 2013. Methods The herpes fluid and/or throat swab specimens were collected from 84 patients clinically diagnosed with varicella zoster in Nanchang from 2010 to 2013，extract DNA from the specimens，amplify ORF22 area and ORF68 area of the virus genome，sequencing，analyze，and compare the sequencing results with VZV reference strains gene sequences in GeneBank.Results There are 55(65.48%)specimens have been detected varicella zoster virus nucleic acid；the sequencing results of ORF22 area compared with representative strains p-Oka and v-Oka of J genotype were found the 6 key sites are exactly the same；the sequencing results of ORF68 area have been found no mutation.Conclusion The epidemic genotype of varicella zoster virus in Jiangxi province from 2010-2013 is J type.

Varicella zoster virus(VZV)；Sequencing；Genotype

R752.1+2，Q523，R446.62

A

1674-1129(2017)01-0014-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.01.004

2016-08-11；

2017-01-11)

江西省卫生厅科技计划课题，编号：20112001；本研究为国家“十一五”科技重大专项“艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治”课题《湖北及周边省传染病病原谱流行规律研究》（2009ZX10004-207）的子课题。

周珺，1985年生，主管技师，主要从事病毒病原学的研究。E-mail：94396465@qq.com