HPV16病毒负荷量与宫颈病变及物理状态的研究

朱义保，谢 彤，杨亮亮，万 磊

(江西省妇幼保健院，江西南昌330006)

HPV16病毒负荷量与宫颈病变及物理状态的研究

朱义保，谢 彤，杨亮亮，万 磊

(江西省妇幼保健院，江西南昌330006)

目的研究HPV16病毒负荷量与宫颈病变及物理状态的关系，探讨反应宫颈病变的指标。方法收集感染HPV16患者的宫颈病变标本，对不同PML2d HPV-16质粒浓度的E2和E7基因进行定量PCR扩增，制作标准曲线，得出HPV16物理状态的临界值，描述标本HPV16的病毒负荷量，并根据临界值，分析HPV16病毒负荷量与宫颈病变及物理状态的关系。结果不同宫颈病变的HPV16中位数病毒负荷量随宫颈病变的级别升高而增加，但病毒负荷量差异无统计学意义（P=0. 22），整合型HPV16在低级别宫颈病变也有较高分布，HPV16物理状态在不同宫颈的分布无统计学意义（P=0.55），不同物理状态间的病毒负荷量差异亦不显著（P=0.34）。结论HPV16病毒负荷量与宫颈病变关系不明显，病毒整合是宫颈病变的早期事件，高的病毒负荷量不会导致整合增加。

HPV16；病毒负荷量；宫颈病变；病毒整合

宫颈癌是女性常见的恶性肿瘤。流行病学资料表明，患者感染高危型HPV并整合入基因组是宫颈癌发生的必要因素，因此高危性HPV的病毒负荷量及物理状态可能与宫颈病变的进展有关。有研究认为[1，2]，病毒负荷量高，免疫清除率低，病毒整合率高，容易导致宫颈病变，病毒负荷量与宫颈病变、病毒整合相关，但也有相反方向的报道[3]，认为病毒负荷量与宫颈病变、病毒整合无关。在本研究中，通过收集住院患者资料，对人乳头瘤病毒HPV16进行分析，探讨HPV16病毒负荷量与宫颈病变、物理状态的关系。

1 资料与方法

1.1 研究对象选取HPV分型检查HPV16阳性的患者，其中慢性宫颈炎21例，CINⅠ4例，CINⅡ22例，CINⅢ23例，宫颈癌28例。所有宫颈细胞标本用塑料毛刷取样。选取的这些患者均无与宫颈病变相关的疾病。

1.2 主要试剂及仪器PML2d HPV-16质粒（P1203）由美国Addgene公司惠赠。DNA提取试剂盒、质粒提取试剂盒、PCR试剂、SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）试剂等购自为北京天为时代公司，ABI 7300实时荧光定量基因扩增仪为美国Applied Biosystems产品。

1.3 样本DNA提取从宫颈管采样，样品分两份，一份做人乳头瘤病毒分型检测，另一份备用，对于人乳头瘤病毒分型检测HPV16阳性的标本，取相应的备用样品提取DNA，相关步骤参见北京天为DNA提取试剂盒。为确认样品HPV16的感染，对提取后的DNA进行HPV16 E7基因扩增，通过凝胶电泳确认样品存在HPV16感染。

1.4 HPV16 E2基因、E7基因、β-actin定量PCR扩增条件引物由华大基因公司合成，具体引物见表1。

表1 引物的序列及扩增条件

1.5 标准曲线的绘制提取PML2d HPV-16质粒，以103-107copies/μl的HPV16质粒为模板，对E2基因、E7基因进行定量扩增，每个浓度检测6次，取不同批次不同浓度下E2和E7基因的CT均数，构建标准曲线。β-actin以人的基因组为模板，分别对500ng/μl、100ng/μl、20ng/μl、4ng/μl、0.8ng/μl的基因组进行β-actin扩增，取不同浓度下的CT值，构建标准曲线。

1.6 病毒负荷量的认定及游离型和混合型HPV16的判定因样本取样的不同，样本组织会呈现误差，取样好的标本病毒负荷量会高，取样差的标本病毒负荷量会低，为剔除这种影响，引入β-actin内参（每个细胞的基因组含量为6.89pg），每个标本细胞的病毒负荷量为E7copy/β-actincopy；对于游离型与混合型HPV16的临界值，取同批次不同浓度下E2/E7比值95%参考值的下限，作为区分游离型和混合型HPV16的临界值。

1.7 统计学方法应用卡方分析和Kruskal-Wallis秩和检验对数据进行统计学分析。

2 结果

2.1 HPV16物理状态的判定HPV16在游离状态下，E2和E7的基因数相同，因此可认为E2/E7＝1是游离型，但在实际过程中，基因扩增存在一定误差，游离状态下的E2/E7比值会在1上下浮动，因此为剔除这种影响，我们对103~107copies/μl质粒浓度的的E2和E7基因进行6次扩增，以E2/E7比值的95%参考值的下限为临界值，来作为判定HPV16是否为游离状态的标准。在本研究中，我们得到30个E2/E7比值，所得值在0.76～1.24之间，95%参考值下限为0.77，因此我们以E2/E7比值0.77为界限，认为大于0.77为游离型HPV16，0和0.77之间为混合型HPV16，等于0为整合型HPV16。

2.2 病毒负荷量与宫颈病变的关系以β-actin做参比，剔除组织取样的影响发现，随着宫颈病变级别的增高，病毒负荷量随之增加，慢性宫颈炎/CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ、宫颈癌的中位数病毒负荷量分别为6.17 copies/μl、11.22copies/μl、18.20copies/μl、23.31 copies/μl，但是分析显示不同宫颈病变的病毒负荷量差异无统计学意义（P=0.22），宫颈病变级别高并不表示病毒负荷量高，表明病毒负荷量与宫颈病变的关系不明显。见图1。

图1 病毒负荷量与宫颈病变的关系

2.3 HPV16物理状态与宫颈病变的关系根据HPV16物理状态的判定标准，慢性宫颈炎/CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ、宫颈癌的HPV16整合率随着宫颈病变级别升高而有所增高，分别为4.00%、9.09%、13.04%、10.71%，分析显示HPV16整合率在不同宫颈病变间的差异无统计学意义（P=0.55），表明HPV16整合与宫颈病变的关系不明显；因混合状态的HPV16也存在HPV16的整合，因此把混合型和整合型的HPV16合并，数据显示慢性宫颈炎/ CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ、宫颈癌的HPV16总整合率分别为48.00%、59.09%、65.22%、75.00%，结果显示HPV16总整合率在不同宫颈病变间分布也不显著（P=0.23），表明HPV16总整合与宫颈病变的关系也不明显。见表2。

表2 HPV16物理状态与宫颈病变的关系

2.4 病毒负荷量与物理状态的关系以往研究认为，病毒负荷量越高，病毒整合发生越多，因此本研究把病毒的物理状态进行区别，分析不同状态下的病毒负荷量的差异，结果发现，整合型、混合型、游离型HPV16的中位数病毒负荷量分别为17.38copies/μl、10.72copies/μl、12.30copies/μl，统计显示不同物理状态下的病毒负荷量差异无显著性，不具有统计学意义（P=0.34），表明病毒负荷量的高低与病毒整合率大小关系不明显。见图2。

图2 病毒负荷量与物理状态的关系

3 讨论

宫颈癌是最常见的妇女生殖系统肿瘤之一。在我国，每年新发病例约14万，占全世界宫颈癌新发病例的29%，死亡率位居妇科肿瘤之首，严重威胁着广大妇女的身心健康。目前研究发现人乳头瘤病毒的感染(human papillomavirus，HPV)，尤其是高危型HPV的感染与宫颈癌的发生密切相关。高危型HPV通过整合入基因组，造成基因组不稳定，抑癌基因下降，癌基因过来表达而致癌，因此研究高危型HPV的病毒负荷量和物理状态，可能与宫颈病变的发展有关。

在本研究中，我们发现与β-actin参比后，慢性宫颈炎/CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ、宫颈癌的中位数病毒负荷量分别为6.17copies/μl、11.22copies/μl、18.20copies/μl、23.31copies/μl，分析显示不同宫颈病变间的病毒负荷量差异无统计学意义，我们的结果与国内的某些报道不同[4，5]，但与国外的多数报道一致[6-8]，认为病毒负荷量与宫颈病变的关系不明显，高级别的宫颈病变不一定表示病毒负荷量高。国内的报道认为，病毒负荷量与宫颈病变相关，但查阅其报道，病毒负荷量与宫颈病变的相关系数较小，相关系数的平方决定系数更小，都在10%~20%以下，表明病毒负荷量在宫颈病变的贡献率在10%~20%以下，所起的作用不足，容易被样本误差或抽样误差掩盖。相反，国外报道认为，病毒负荷量与宫颈病变关系不明显，HPV病毒负荷量的取样只在一个时间点，时间点取样后的病毒负荷量变化并不能知道，缺乏动态观察，因此一个时间点的病毒负荷量不能反应其与宫颈病变的关系。而且即使动态观察，研究发现病毒负荷量与宫颈病变之间的关系也偏低或不明显，如Constandinou报道[9]，HPV16和HPV18动态的病毒负荷量与宫颈病变的危险度只有1.76（95%CI 1.38~2.25）和1.59（95%CI 1.25~2.03），或如Manawapat报道[10]，HPV16感染观察一段时间后，不管是感染后清除的患者、持续进展的患者、还是CINⅢ以上的患者，病毒负荷量之间均无统计学意义，动态的病毒负荷量不能反应宫颈病变的程度。

HPV病毒整合入基因组，导致宿主基因的不稳定，激活癌基因，因此病毒的物理状态也是考量宫颈病变的指标。但在我们的报道中，不管是HPV16纯整合率还是整合型与混合型合并后的HPV16总整合率，在慢性宫颈炎/CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ、宫颈癌的分布中均无差异，没有统计学意义，病毒整合率和宫颈病变关系不明显，病毒整合率没有随宫颈病变的级别升高而升高。在慢性宫颈炎/CINⅠ组中，HPV16就有48.00%的病毒整合率，宫颈病变早期就有HPV16整合，表明病毒整合是宫颈病变的早期事件[10-12]。

此外，亦有报道认为，病毒负荷量越多，病毒整合入基因组愈多。在我们的报道中，不同物理状态下，整合型、混合型、游离型HPV16的中位数病毒负荷量分别为17.38copies/μl、10.72copies/μl、12.30copies/μl，分析显示不同物理状态下的病毒负荷量差异无统计学意义，与Cheung报道一致[13，14]，表明病毒负荷量高不一定会导致病毒整合率高。

综上所述，我们认为HPV16病毒负荷量与宫颈病变关系不明显，病毒负荷量高，病毒整合率不一定高，高病毒负荷量不增加病毒整合率，病毒整合率高，宫颈病变程度不一定严重，病毒整合是宫颈病变的早期事件。

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Analysis of HPV 16 viral load with cervical lesions and physical states

ZHU Yibao，XIE Tong，YANG Liangliang，WAN Lei. Jiangxi Maternal and Child Care Service Centre，Nanchang 330006，China.

Objective To study the correlations of HPV 16 viral load with cervical lesions and physical states，and investigate the index of cervical lesions.Methods HPV16 infected samples were collected，standard curves were made，then we analysed the HPV16 viral load，found the threshold distinguished episomal and mixed HPV16，and check the infected HPV16 states according the threshold.ResultsThe median of HPV16 viral load increased with the degree of cervical lesions，but statistical analysis showed no difference，the integration type of HPV16 also happened in low grade cervical lesions with a high frequency，HPV16 integration rates among the different cervical lesions showed no significance，and HPV16 viral load among the different physical states showed no significance too.Conclusions There was no obvious relationship between HPV16 viral load and cervical lesions，viral integration is an early event，and high viral load would not increase intergration rate.

HPV16；Viral load；Cervical lesions；Viral integration

R737.33，R446.62

A

1674-1129(2017)01-0017-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.01.005

2016－07－01；

2016－11－16)

1、江西省卫计委科技计划课题（20165443）；2、江西省自然科学基金（20132BAB205003）

朱义保，男，1980年生，硕士，妇产科主治医师，妇科肿瘤方向。

万磊，女，1974年生，博士，妇产科主任医师，妇科肿瘤方向，E-mail:18070393566@163.com