外源性硫化氢对肝星状细胞TGF-β1表达的影响

程敏，郑勇，陈卫刚，康馨丹，张迪，徐丽红

(1石河子大学医学院，新疆石河子832000；2石河子大学医学院第一附属医院)

·基础研究·

外源性硫化氢对肝星状细胞TGF-β1表达的影响

程敏1，郑勇2，陈卫刚2，康馨丹1，张迪1，徐丽红2

(1石河子大学医学院，新疆石河子832000；2石河子大学医学院第一附属医院)

目的 探讨外源性硫化氢(H2S)对大鼠肝星状细胞(HSC)转化生长因子β1(TGF-β1)表达的影响。方法 体外培养大鼠HSC-T6，随机将细胞分为5组：空白对照组和硫氢化钠(NaHS)50、75、100、200 μmol/L组，空白对照组仅给予L-DMEM，NaHS 50、75、100、200 μmol/L组分别给予含相应浓度NaHS的L-DMEM，培养48 h。采用Western blotting法和qRT-PCR法检测各组TGF-β1蛋白及其mRNA表达。结果 各组均可见TGF-β1表达，证实各组HSC-T6均处于活化状态，可模拟肝纤维化状态下的HSC。培养48 h，NaHS 50 μmol/L组TGF-β1蛋白和mRNA表达最低，NaHS 75 μmol/L组TGF-β1蛋白和mRNA表达已明显升高，但仍低于空白对照组(P均<0.01)；NaHS 100、200 μmol/L组TGF-β1蛋白和mRNA表达明显高于空白对照组(P均<0.01)。结论 在一定浓度范围内外源性H2S可延缓肝纤维化的进展，其机制与抑制TGF-β1表达有关。

肝纤维化；硫化氢；肝星状细胞；转化生长因子β1

肝纤维化是以细胞外基质(ECM)在肝脏弥漫性过度沉积为病理特征，其形成主要是由于肝脏受到外界刺激因子损伤后，肝星状细胞(HSC)活化，ECM过度生成，降解相对不足，导致ECM在肝内大量沉积所致[1]。肝纤维化如得不到有效逆转，最终将演变为肝硬化。因此，肝纤维化是慢性肝损伤转变为不可逆性肝硬化的必经之路。有研究发现，转化生长因子β1(TGF-β1)在HSC活化到ECM过度沉积的过程中具有重要作用[2]。本课题组前期研究发现，硫化氢(H2S)作为继NO、CO之后第3种内源性气体信号分子，能够延缓肝纤维化的进展[3,4]。在体内H2S以两种形式存在，大部分以HS-形式存在并发挥生理作用，小部分以H2S气体形式存在。硫氢化钠(NaHS)在溶液中解离为Na+和HS-，HS-与H+结合生成H2S，从而使液体中NaHS和H2S保持动态平衡。与H2S相比，NaHS更能保证溶液中H2S浓度的稳定性和精确性，常被用于外源性H2S的供体。2016年1～6月，本研究观察了NaHS对HSC TGF-β1表达的影响，旨在进一步明确外源性H2S的作用及其机制。现分析结果并报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 大鼠HSC-T6，购自自广州吉妮欧生物科技有限公司；FBS、L-DMEM，购自美国Hyclone公司；NaHS，购自美国Sigma公司；TGF-β1抗体，购自美国Abcam公司；小鼠抗β-actin单克隆抗体，山羊抗小鼠、山羊抗兔IgG均购于北京中杉金桥生物技术有限公司；TRIzol，购自美国Invitrogen公司；逆转录试剂盒，购自美国Thermo公司；SYBR Gene PCR试剂盒，购自德国QIAGEN公司；异丙醇、三氯甲烷，购自上海化学试剂研究所有限公司；TGF-β1、β-actin引物自行设计，并由上海生工生物工程股份有限公司合成；Bio-Rad电泳仪、转膜仪、凝胶成像仪，均购自美国Bio-Rad公司；核酸蛋白测定仪、SYBR Green Ⅰ实时定量PCR仪，购自美国Thermo公司；PCR扩增仪，购自日本TaKaRa公司。

1.2 细胞培养及分组处理 取HSC-T6约2×106个，接种于细胞培养皿中，用含10%FBS的L-DMEM完全培养基培养至细胞80%～90%融合时，0.25%胰蛋白酶消化成单个细胞，1 000 r/min离心5 min，弃去上清液，用1 mL完全培养基重悬细胞。将细胞悬液接种至新的培养皿中，细胞贴壁6～8 h，PBS清洗2次，去除漂浮死细胞及残存血清，换用无任何血清添加的L-DMEM，同步化处理12 h。随机将细胞分为空白对照组和NaHS 50、75、100、200 μmol/L组，空白对照组仅给予L-DMEM，NaHS 50、75、100、200 μmol/L组分别给予含相应浓度NaHS的L-DMEM，培养48 h。

1.3 TGF-β1蛋白表达检测 采用Western blotting法。取各组细胞，用冰冷PBS洗涤2～3次，冰上裂解，机械匀浆，4 ℃ 12 000 r/min离心15 min，取上清液，BCA法蛋白定量。取总蛋白10 μL，行10% SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳(80 V 30 min，110 V 100 min)，半干法转印至PVDF膜(23 V 50 min)，5%脱脂奶粉封闭2 h，4 ℃ 20 r/min摇床一抗(TGF-β1、β-actin均为1∶1 000)孵育过夜。次日，1×TBST洗脱一抗5～6次，5 min/次，常温下二抗(1∶20 000)孵育2 h，1×TBST洗脱5～6次，5 min/次，将发光试剂混匀后滴加到PVDF膜上，暗室曝光。Bio-Rad凝胶成像仪采集图像后，采用Gel-Proanalyzer软件分析各泳道条带灰度值。以目的蛋白与β-actin条带灰度值之比表示目的蛋白的相对表达量。实验重复3次，取平均值。

1.4 TGF-β1mRNA表达检测 采用qRT-PCR法。利用TRIzol法提取各组总RNA，经核酸蛋白测定仪检测，OD260/OD280在1.8～2.0，琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA完整，可满足实验要求。采用RevertAidTMH Minus First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒将总RNA逆转录为cDNA。PCR扩增：TGF-β1上游引物：5′-ATTCCTGGCGTTACCTTGG-3′，下游引物：5′-AGCCCTGTATTCCGTCTCCT-3′，产物片段120 bp；β-actin上游引物：5′-CGTAAAGACCTCTATGCCAACA-3′，下游引物5′-AGCCACCAATCCACACAGAG-3′，产物片段163 bp；PCR反应体系20 μL，其中cDNA 3 μL、上下游引物各1 μL、2×Synthesis qPCR Master Mix混合物10 μL、DEPC水5 μL；扩增条件：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性10 s，55 ℃退火延伸30 s，共39个循环。每个样本设3个复孔。以β-actin为内参，2-ΔΔCt法计算TGF-β1mRNA的相对表达量。

2 结果

各组均可见TGF-β1表达，证实各组HSC-T6均处于活化状态，可模拟肝纤维化状态下的HSC。培养48 h，NaHS 50 μmol/L组TGF-β1蛋白和mRNA表达最低，NaHS 75 μmol/L组TGF-β1蛋白和mRNA表达已明显升高，但仍低于空白对照组(P均<0.01)；NaHS 100、200 μmol/L组TGF-β1蛋白和mRNA表达明显高于空白对照组(P均<0.01)。结果见表1。

表1 各组TGF-β1蛋白和mRNA的相对表达量比较

注：与空白对照组比较，*P<0.01；与NaHS 50 μmol/L组比较，#P<0.01；与NaHS 75 μmol/L组比较，△P<0.01；与NaHS 100 μmol/L组比较，▲P<0.01。

3 讨论

肝纤维化是由多种损伤因素，包括病毒、药物、胆汁淤积、自身免疫等引起的病理过程，在TGF-β1、血小板衍生生长因子、结缔组织生长因子及炎性因子等相互作用下， HSC直接或间接被激活并分泌大量ECM[5]，致使肝脏结构被破坏及肝实质被损伤。其中，TGF-β1是肝纤维化形成过程中最核心的细胞因子。TGF-β1一方面可不断促进ECM的合成与分泌[6]，另一方面抑制ECM的降解，破坏基质的平衡状态[7]。作为致肝纤维化最强的细胞因子，TGF-β1在体内分布以肝脏居首，且肝内TGF-β1活性明显高于其他组织。因此，抑制肝脏TGF-β1表达，减少HSC TGF-β1生成，对延缓肝纤维化进程尤为重要。

在有关肝纤维化模型的研究中，经常用到原代或传代HSC。原代培养的HSC通常用于研究相对静止的HSC状态，而传代培养的HSC常被用来模拟肝纤维化状态下的急性模型。在正常肝脏中，HSC比例仅占非实质细胞的5%～10%，且提取原代HSC的效率较低；同时，原代细胞的纯化技术及培养条件对HSC状态的影响较大，容易对实验结果造成影响。因此，目前有关肝纤维化的研究多选用传代的HSC。HSC-T6是一种永生系细胞，经过SV40病毒转染后形成，可模拟肝纤维化状态下的HSC，具有无限传代的特性。故本研究选用HSC-T6进行后续实验。

H2S是继NO、CO之后发现的第3种具有类似生理效应的气体分子。有研究发现，H2S具有调节细胞增殖、控制细胞周期、抗氧化应激、扩张血管等多种生物学效应[8，9]。在体内生理环境下，H2S在胱硫醚-B-合成酶、胱硫醚-C-裂解酶体系的作用下生成并发挥生理作用[10]。有研究发现，体内H2S含量随着肝硬化程度的加重逐渐降低[11]。丁彦光等[12]研究发现，给予肝纤维化大鼠充足的外源性H2S，可清除自由基、提高抗氧化物酶活性、抑制HSC胶原合成、减少肝组织ECM沉积，抑制大鼠肝纤维化进展。Song等[13]研究发现，NaHS用于TGF-β1诱导的肾纤维化大鼠，可使肾组织α-平滑肌肌动蛋白、纤维黏连蛋白、Ⅰ型胶原表达明显降低。自发性高血压大鼠经NaHS处理后，心肌组织TGF-β1表达及心肌胶原明显降低[14]。大鼠血浆中H2S浓度一般为(41±5) μmol/L[15]，本课题组前期研究发现，NaHS 200 μmol/L以下时对HSC及肝细胞凋亡无明显诱导作用[16,17]。故本研究选取50～200 μmol/L的NaHS作用于HSC，观察其对TGF-β1表达的影响，为NaHS在延缓肝纤维化方面的研究提供一定的理论依据。

在正常未活化的HSC中，TGF-β1表达极少，很难被检测到，而HSC活化后可大量分泌[18]。本研究各组均可见TGF-β1表达，表明本研究所用的HSC已经活化，可模拟肝纤维化状态下的HSC。本研究选择50、75、100、200 μmol/L NaHS作用于HSC-T6 48 h，结果发现，NaHS 50 μmol/L时TGF-β1蛋白和mRNA表达最低， NaHS 75 μmol/L时TGF-β1蛋白和mRNA表达已明显升高，但仍低于空白对照组；当NaHS 100、200 μmol/L时TGF-β1蛋白和mRNA表达明显高于空白对照组。表明在一定浓度范围内外源性H2S可抑制TGF-β1表达。Song等[13]将外源性H2S腹腔注射至单侧输尿管梗阻大鼠中，发现H2S的保护作用表现为“钟型”量效关系，即NaHS的保护效应起于5.6 g/(kg·d)，达峰于56 g/(kg·d)，并于560 g/(kg·d)时发生逆转。本研究与Song等[13]报道类似。其原因可能与H2S的“钟型”量效关系有关，但其具体机制尚需进一步探讨。有研究证实，NF-κB具有多向调节作用，可调控多种细胞因子的转录，包括促进TGF-β1基因的表达[19]。外源性H2S调节大鼠肝纤维化的过程中，可降低肝组织匀浆上清液中细胞因子TNF-α表达[20]，而TNF-α表达与NF-κB p65的表达呈正相关关系[21]。因此，NaHS可能通过抑制TNF-α、NF-κB的表达，影响TNF-α/NF-κB信号通路，进而抑制TGF-β1的表达。

综上所述，在一定浓度范围内外源性H2S可延缓肝纤维化的进展，其机制可能与抑制TGF-β1表达有关。

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国家自然科学基金资助项目(81170402、81360076)。

郑勇(E-mail： zy2850@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.08.008

R575.2

A

1002-266X(2017)08-0029-03

2016-07-13)