姜黄素对ALD小鼠的肝保护作用及机制

董雪娜，徐力力

(1山东省立医院，济南250021；2济南市传染病医院)

姜黄素对ALD小鼠的肝保护作用及机制

董雪娜1，徐力力2

(1山东省立医院，济南250021；2济南市传染病医院)

目的 探讨姜黄素对酒精性肝病(ALD)小鼠的肝保护作用及其可能的作用机制。方法 选择昆明小鼠50只，随机分为对照组、模型组和姜黄素低、中、高剂量组，每组10只。模型组及姜黄素低、中、高剂量组采用持续乙醇灌胃法建立小鼠ALD模型。同期，对照组和模型组给予等量蒸馏水灌胃，姜黄素低、中、高剂量组分别给予姜黄素50、100、200 mg/(kg·d)灌胃，持续4周。观察各组体质量、肝质量、肝脏指数以及肝脏病理形态变化，检测各组血清ALT、AST、TG及肝组织匀浆超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)，Western blotting法检测肝组织TNF-α、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)的表达。结果 姜黄素低、中、高剂量组病理改变较模型组均有不同程度改善，姜黄素中、高剂量组肝脏指数及血清ALT、AST和TG水平均显著低于模型组(P均<0.05)；与模型组比较，姜黄素高剂量组肝组织MDA含量显著降低，姜黄素中、高剂量组肝组织GSH含量以及SOD、GSH-Px酶活性显著升高(P均<0.05)；姜黄素高剂量组肝组织TNF-α、MCP-1表达明显低于模型组(P均<0.05)。结论 姜黄素对ALD小鼠具有肝保护作用，以姜黄素高剂量组效果最显著；其机制可能与抑制氧化应激和炎性反应有关。

酒精性肝病；姜黄素；氧化应激；炎性反应；小鼠

酒精性肝病(ALD)是酒精摄入过多导致的肝脏损伤性疾病，其发病机制涉及酒精及其代谢产物的直接肝毒性、氧化应激与脂质过氧化反应、免疫炎症反应等多个方面[1～3]。姜黄素作为天然姜黄属植物根茎中提取出来的一种多酚类色素，具有广泛的生物活性和药理作用，在抗炎、抗氧化以及抗肿瘤等方面效果显著。研究发现，姜黄素还能缓解ALD所致的肝损伤，具有护肝作用[4～6]。2014年3月～2015年1月，我们观察了姜黄素对ALD小鼠的肝保护作用。现分析结果并探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 雄性昆明小鼠50只，SPF级，体质量18～22 g，由山东大学实验动物中心提供，动物许可证号：SYXK(鲁)20130001。所有小鼠分笼喂养，自由进食，任意饮水，温度为18～20 ℃、湿度为50%～60%，明暗周期12 h。主要仪器：DYY-15D型电泳仪，北京六一生物科技有限公司；BS-490全自动生化分析仪，深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司；UV759S分光光度计，上海精密科学仪器有限公司。主要试剂：市售56 ℃二锅头白酒，北京红星股份有限公司；姜黄素，纯度95%，陕西森弗生物技术有限公司；丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒，南京建成生物工程研究所；TG、ALT、AST检测试剂盒，深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司；MCP-1羊多克隆抗体、TNF-α羊多克隆抗体，美国Santa Cruz公司；β-actin兔多克隆抗体，武汉博士德生物工程有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 动物分组及处理 所有小鼠适应性饲养1周，随机分为对照组、模型组及姜黄素低、中、高剂量组，每组10只。姜黄素低、中、高剂量组预先给予姜黄素50、100、200 mg/(kg·d)灌胃，连续7天。模型组及姜黄素低、中、高剂量组均给予56°二锅头白酒15 mL/(kg·d)灌胃。每天白酒灌胃前30 min，对照组和模型组给予等量蒸馏水灌胃，姜黄素低、中、高剂量组给予姜黄素50、100、200 mg/(kg·d)灌胃。各组均连续灌胃4周。

1.3 相关指标观察

1.3.1 肝脏指数及肝脏病理形态 各组末次灌胃后禁食16 h、不禁水，摘除眼球采血1 mL，保存备检。处死前称取体质量，断颈处死，立即取出肝脏，称质量，计算肝脏指数。肝脏指数=肝脏质量/体质量×100%。取部分肝组织，4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，5 μm厚连续切片，HE染色，光镜下观察肝组织病理形态变化。

1.3.2 血清ALT、AST、TG及肝组织匀浆MDA、SOD、GSH、GSH-Px水平 所有血样静置2 h，4 ℃ 3 500 r/min离心10 min，取上层血清，-20 ℃保存。采用全自动生化分析仪、速率法检测血清ALT、AST、TG。称取各组肝组织0.4 g，置于组织匀浆器中，加入生理盐水4 mL，冰上研磨，制成10%组织匀浆；采用硫代巴比妥酸法检测组织匀浆MDA含量，黄嘌呤氧化酶法检测组织匀浆SOD活性，可见光法检测组织匀浆GSH含量，二硫代二硝基苯甲酸法检测组织匀浆GSH-Px活性。所有操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.3.3 肝组织匀浆MCP-1和TNF-α水平 采用Western blotting法。称取肝组织100 mg，置于组织匀浆器中，加入预冷的裂解液(含PMSF 1 μL)1 mL，冰上研磨，制备组织裂解液。冰浴上充分裂解，4 ℃ 12 000 r/min离心5 min，取上清。BCA法进行蛋白定量，取蛋白样品30 μg行SDS-PAGE电泳，采用湿转法将蛋白转印至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭后，分别加入MCP-1、TNF-α、β-actin多克隆抗体，4 ℃孵育过夜。TBST洗膜后加入相应的辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1 h，胶片曝光、显影后进行灰度分析。以目的条带灰度值/β-actin条带灰度值作为目的蛋白的相对表达量。

2 结果

2.1 各组肝组织病理形态变化 对照组可见正常

肝细胞以中央静脉为中心呈放射状排列，形态、结构正常。模型组肝小叶结构紊乱，肝细胞出现大量空泡性脂肪病变，胞质疏松，局部可见肝细胞点状坏死和炎性细胞浸润，说明模型制备成功。姜黄素低、中、高剂量组肝组织脂肪变性、细胞肿胀坏死及炎性病变均得到不同程度改善，以姜黄素高剂量组效果最明显。见插页Ⅱ图3。

2.2 各组体质量、肝质量和肝脏指数比较 见表1。

表1 各组体质量、肝质量和肝脏指数比较±s)

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与姜黄素低剂量组比较，◆P<0.05。

2.3 各组血清ALT、AST、TG及肝组织匀浆MDA、SOD、GSH和GSH-Px水平比较 见表2、3。

表2 各组血清ALT、AST、TG水平比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与姜黄素低剂量组比较，◆P<0.05。

表3 各组肝组织匀浆MDA、SOD、GSH、GSH-Px水平比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与姜黄素低剂量组比较，◆P<0.05。

2.4 各组肝组织MCP-1、TNF-α表达比较 上述结果提示，姜黄素高剂量组肝保护效果最显著。故本研究仅比较对照组、模型组、姜黄素高剂量组肝组织MCP-1、TNF-α表达。结果见表4。

表4 各组肝组织MCP-1、TNF-α相对表达量比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。

3 讨论

酒精在肝脏中代谢会导致肝细胞内氧化还原状态失衡，氧化应激水平升高，继而肝细胞的肿胀坏死，肝功能失常，最终导致ALD[1～3]。肝脏指数是肝脏质量与体质量的比值。肝脏受损后，肝脏指数可发生明显变化，能反映肝脏病变程度[7]。ALD以肝细胞微管受损和脂质代谢紊乱为主要表现，细胞肿胀、胞质疏松，可见散在或广泛脂滴，是ALD最早和最常见的病理改变[8，9]。本研究结果发现，模型组肝脏指数明显增高，细胞内可见典型脂肪和炎性病理改变，证实ALD模型制备成功；与模型组比较，姜黄素各剂量组肝脏指数升高和细胞肿胀程度明显缓解，尤其是姜黄素高剂量组效果更明显，说明姜黄素对ALD具有肝保护作用。

ALT和AST是评价肝细胞损伤的特异性指标，TG是肝脏脂肪合成和代谢的重要指标，临床上一般通过ALT、AST和TG水平来判断肝损伤程度[10]。本研究结果发现，模型组血清ALT、AST、TG水平均显著升高，说明ALD模型制备成功，而姜黄素各剂量组能显著缓解这一状况，进一步说明姜黄素对ALD具有一定的肝保护作用。

SOD和GSH-Px是肝脏抗氧化的关键酶系，具有清除自由基和过氧化物的作用；GSH是主要的还原剂，对维持机体的氧化和抗氧化平衡起着至关重要的作用；MDA是最主要的脂质过氧化产物之一，可反映体内脂质过氧化的程度和自由基的生成情况，并可间接反映自由基攻击机体细胞的严重程度[2，3]。大量乙醇在氧化代谢时会迅速消耗肝内的抗氧化物质，从而无法清除过多的自由基，导致脂质过氧化产物迅速增加，肝细胞膜受损。以往研究证实，姜黄素具有很强的抗氧化作用[4～6]。本研究模型组肝组织GSH含量以及SOD、GSH-Px酶活性均显著降低，MDA含量显著增加，说明模型组肝脏存在明显的氧化应激反应，这可能是诱发ALD的主要原因，与以往文献[11，12]研究结果基本一致。与模型组比较，姜黄素各剂量组上述指标均有不同程度改善，以姜黄素高剂量组效果最显著，表明姜黄素能保护肝细胞，改善乙醇所致肝脏的氧化应激反应，从侧面说明姜黄素可能作为抗氧化剂发挥ALD的肝保护作用。

TNF-α是在炎症刺激下由巨噬细胞、单核细胞等特定细胞产生的促炎性细胞因子，在诱发慢性炎症、促进器官纤维化的进程中起着重要作用[12]；MCP-1属于趋化因子家族，主要与CCR2结合，介导细胞内的信号传导，MCP-1的异常表达与多种炎症和器官纤维化密切相关[13，14]。Mandrekar等[15]研究发现，MCP-1和TNF-α主要生成于激活的Kuffer细胞和肝星状细胞，在乙醇喂饲的正常小鼠肝脏中均高表达，而MCP-1敲除小鼠肝脏TNF-α、IL-1β、IL-6、KC/IL-8等促炎性细胞因子表达明显受到抑制，说明MCP-1和TNF-α在ALD的发生中具有重要作用。本研究模型组肝组织TNF-α、MCP-1相对表达量均明显升高，表明TNF-α、MCP-1可用于评价ALD的肝损伤；姜黄素高剂量组TNF-α、MCP-1相对表达量明显低于模型组。说明姜黄素可能通过降低TNF-α、MCP-1表达发挥抗炎作用。

总之，姜黄素对ALD小鼠具有肝保护作用，以200 mg/(kg·d)效果最显著；其机制可能与抗氧化和抗炎活性有关。姜黄素可能通过提高清除自由基的酶活性，抑制自由基介导的脂质过氧化反应和炎症因子表达，减轻ALD所致的肝损伤。

[1] Gao B, Bataller R. Alcoholic liver disease: pathogenesis and new therapeutic targets[J]. Gastroenterology, 2011,141(5):1572-1585.

[2] Zhu R, Wang Y, Zhang L, et al. Oxidative stress and liver disease[J]. Hepatol Res, 2012,42(8):741-749.

[3] Nagy LE. The role of innate immunity in alcoholic liver disease[J]. Alcohol Res, 2015,37(2):237-250.

[4] Xiong ZE, Dong WG, Wang BY, et al. Curcumin attenuates chronic ethanol-induced liver injury by inhibition of oxidative stress via mitogen-activated protein kinase/nuclear factor E2-related factor 2 pathway in mice[J]. Pharmacogn Mag, 2015,11(44):707-715.

[5] Rong S, Zhao Y, Bao W, et al. Curcumin prevents chronic alcohol-induced liver disease involving decreasing ROS generation and enhancing antioxidative capacity[J]. Phytomedicine, 2012,19(6):545-550.

[6] Vera-Ramirez L, Pérez-Lopez P, Varela-Lopez A, et al. Curcumin and liver disease[J]. Biofactors, 2013,39(1):88-100.

[7] 彭勃，苗明三，朱平生，等.橄榄解酒饮对大小鼠急性酒精性肝损伤脂质代谢的影响[J].河南中医学院学报，2003，18(1)：16-17.

[8] Mathews S, Xu M, Wang H, et al. Animals models of gastrointestinal and liver diseases. Animal models of alcohol-induced liver disease: pathophysiology, translational relevance, and challenges[J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2014,306(10):G819-G823.

[9] Sid B, Verrax J, Calderon PB. Role of oxidative stress in the pathogenesis of alcohol-induced liver disease[J]. Free Radic Res, 2013,47(11):894-904.

[10] Rao KN, Virji MA, Moraca MA, et al. Role of serum markers for liver function and liver regeneration in the management of chloroform poisoning[J]. J Anal Toxicol, 1993,17(2):99-102.

[11] Ceni E, Mello T, Galli A. Pathogenesis of alcoholic liver disease: role of oxidative metabolism[J]. World J Gastroenterol, 2014,20(47):17756-17772.

[12] Zelová H, Hošek J. TNF-α signalling and inflammation: interactions between old acquaintances[J]. Inflamm Res, 2013,62(7):641-651.

[13] Yadav A, Saini V, Arora S. MCP-1: chemoattractant with a role beyond immunity: a review[J]. Clin Chim Acta, 2010,411(21):1570-1579.

[14] 方向群，朱元钰，胡晓玲，等.氯沙坦对大鼠肺纤维化模型的干预作用及对MCP-1和bFGF表达的影响[J].中华结核和呼吸杂志，2002，25(5)：268-272.

[15] Mandrekar P, Ambade A, Lim A, et al. An essential role for monocyte chemoattractant protein-1 in alcoholic liver injury: regulation of proinflammatory cytokines and hepatic steatosis in mice[J]. Hepatology, 2011,54(6):2185-2197.

徐力力(E-mail： xull0531@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.08.012

R575.5

A

1002-266X(2017)08-0041-03

2016-03-18)