肝细胞癌患者血清miRNA-200c表达变化及其临床意义

李涛，牛丽娟，李曼，刘文宣，杨磊，马丽霞

(1河北医科大学公共卫生学院，石家庄 050017；2石家庄市第三医院)

肝细胞癌患者血清miRNA-200c表达变化及其临床意义

李涛1，牛丽娟2，李曼1，刘文宣1，杨磊1，马丽霞2

(1河北医科大学公共卫生学院，石家庄 050017；2石家庄市第三医院)

目的 探讨肝细胞癌(HCC)患者血清miRNA-200c表达变化及其临床意义。方法 选择HCC患者60例(HCC组)、体检健康者60例(对照组)，采用实时荧光定量PCR技术检测两组血清miRNA-200c表达，并分析其表达与患者临床病理参数的关系。以血清miRNA-200c表达的均数为界值，分为miRNA-200c高表达和miRNA-200c低表达者，比较二者生存时间。结果 HCC组及对照组血清miRNA-200c相对表达量分别为0.51±0.11、0.78±0.13，两组比较P<0.01。HCC患者miRNA-200c低表达与肿瘤直径、TNM分期有关(P均<0.01)。miRNA-200c高表达者生存时间明显长于miRNA-200c低表达者(χ2=8.551，P<0.01)。结论 HCC患者血清miRNA-200c低表达，其表达变化可促进HCC的发生、发展，并与患者预后有关。

肝细胞癌；微小RNA-200c；生存时间；实时荧光定量PCR技术

肝细胞癌(HCC)是我国最常见的恶性肿瘤之一，每年死亡人数约12万，占全世界HCC死亡人数的40%左右[1]，其发病机制目前尚未完全清楚。微小RNA(miRNA)是一类非编码蛋白的单链RNA，通过与靶mRNA结合，引起转录后的基因沉默。有研究表明，miRNA与多种肿瘤的发生、发展及转归密切相关[2]。miRNA-200c是miRNA-200家族的重要成员，在多种肿瘤组织中异常表达，是近年临床研究的热点[3]。2010年1月～2015年12月，我们观察了HCC患者血清miRNA-200c表达变化，并分析其表达变化与患者临床病理参数及预后的关系。现分析结果并报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择同期石家庄市第三医院收治的HCC患者60例(HCC组)，均为首次确诊，尚未接受任何抗肿瘤治疗，并排除既往有肿瘤史者。其中，男42例、女18例，年龄(58.6±10.2)岁；肿瘤直径≤5 cm者31例，>5 cm者29例；TNM分期：Ⅰ、Ⅱ期20例，Ⅲ、Ⅳ期40例；有淋巴结转移者33例，无淋巴结转移者27例；血清AFP≤200 ng/mL者19例，>200 ng/mL者41例；有HBV感染者44例，无HBV感染者16例；有肝硬化史者46例。同期选择在该院体检的健康志愿者60例(对照组)，男40例、女20例，年龄(57.3±9.4)岁。两组性别、年龄具有可比性。本研究经石家庄市第三医院伦理委员会批准，患者均知情同意。

1.2 血清miRNA-200c表达检测 HCC组于确诊日，对照组于体检日，采集空腹肘静脉血3～5 mL，常温静置30 min，3 000 r/min离心20 mim，取上层血清，置于无RNA酶的EP管中，-80 ℃超低温冰箱保存。②mRNA提取及逆转录：将血清标本于37 ℃水浴中解冻，采用血清mRNA快速提取试剂盒提取总RNA，利用分光光度计检测总RNA的纯度，当OD260/OD280为1.8～2.0时，可用于后续试验。采用mRNA逆转录试剂盒将总RNA逆转录为cDNA，反应体系20 μL：六碱基随机引物1 μL(0.2 μg)，总RNA 2 μg，RNA酶抑制剂(2 U/μL) 1 μL，10 mmol/L dNTP 2 μL，5×buffer 4 μL，反转录酶(200 U/μL) 1 μL，余用DEPC水补足至20 μL。反应条件：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。采用实时荧光定量PCR技术检测miRNA-200c：以cDNA为模板，按照实时荧光定量PCR试剂盒要求，在Rotor-GeneTM6000 PCR仪中进行实时荧光定量PCR反应。miRNA-200c上游引物：5′-GCCGATTTAATACTGCCGGGT-3′，下游引物：5′-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′，以miRNA-16为内参。反应体系：2×buffer 10 μL，上下游引物各1 μL，模板cDNA 2 μL，余用DEPC水补足至20 μL。反应条件：95 ℃ 10 min，94 ℃ 30 s，56 ℃ 20 s，70 ℃ 15 s，共40个循环。每个样本重复3次，取平均值为Ct值，计算ΔCt值，ΔCt=CtmiRNA-200c-CtmiRNA-16，采用相对定量的2-ΔCt法计算miRNA-200c的相对表达量。以HCC组血清miRNA-200c相对表达量的均数为界值，将患者分为miRNA-200c高表达者、miRNA-200c低表达者。

1.3 随访 采用门诊和电话随访相结合，随访截至2016年6月30日，统计每例患者的生存时间。

2 结果

2.1 两组血清miRNA-200c表达比较 HCC组血清miRNA-200c相对表达量为0.51±0.11，对照组为0.78±0.13，两组比较差异有统计学意义(t=8.684，P<0.01)。

2.2 血清miRNA-200c表达与HCC患者临床病理参数的关系 以HCC患者血清miRNA-200c相对表达量的均数为界值，将患者分为miRNA-200c高表达者30例、miRNA-200c低表达者30例。血清miRNA-200c表达与HCC患者临床病理参数的关系见表1。

表1 血清miRNA-200c表达与HCC患者临床病理参数的关系

2.3 HCC组不同miRNA-200c表达者生存情况 随访截至2016年6月30日，20例miRNA-200c高表达者生存15例，平均生存时间29.7个月；22例低表达者生存9例，平均生存时间21.1个月。miRNA-200c高表达者生存时间长于低表达者(χ2=8.551，P=0.003)。见图1。

图1 HCC组不同miRNA-200c表达者的生存曲线

3 讨论

据统计， HCC的病死率居所有恶性肿瘤的第三位[4]。我国是HCC高发国，全球每年约50.5%的新发HCC患者出现在我国[5]。HCC起病隐匿，早期症状不明显，但恶性程度高，病情发展迅速，大多数患者确诊时已属中晚期，治疗效果较差，5年生存率仅7%左右[6，7]。因此，寻找早期诊断HCC的分子标志物对其防治具有重要意义。

miRNAs分子是一类由19～23个核苷酸组成的内源性非编码RNA，可通过特异性的靶基因沉默调控基因表达，在肿瘤的早期诊断、治疗监测以及预后评估中具有重要价值，且与肿瘤的发生、发展关系密切[8，9]。miRNA-200家族包括miRNA-200a、miRNA-200b、miRNA-200c、miRNA-429和miRNA-141五个成员[10]。miRNA-200a、miRNA-200b和miRNA-429均定位于人1号染色体1p36.33区，miRNA-200c和miRNA-141定位于人12号染色体12p13.31区，这两个区域的染色体经常出现突变、缺失或易位，继而导致肿瘤的发生[11]。miRNA-200c在肿瘤发生、发展中的作用机制可能与上皮间质转化(EMT)有关。EMT是在特定的生理和病理情况下上皮细胞转化为间质细胞的过程，通过EMT可改变细胞骨架、减弱基底膜与细胞间的连接、E-钙黏着蛋白(E-cadherin)等细胞黏附分子表达减少、细胞极性丧失[12]。EMT是肿瘤细胞获得迁移和侵袭能力的一个重要步骤。其中，E-cadherin表达减少被认为是EMT的重要特征之一[13]。已有研究表明，miRNA-200c可通过上调E-cadherin抑制EMT过程，从而抑制肿瘤细胞侵袭和转移，E-cadherin是参与调控肿瘤EMT的重要调节因子[14,15]。在不同肿瘤中miRNA-200c表达情况并不一致。Zhao等[16]研究发现，非小细胞肺癌患者血清miRNA-200c低表达，且其表达与肿瘤TNM分期相关。常靓等[17]研究发现，胃癌患者血清miRNA-200c低表达，且与肿瘤组织分化程度有关。而Yu等[18]研究发现，食管癌患者血清miRNA-200c高表达。李林霞等[19]研究发现，卵巢癌患者血清miRNA-200c表达呈现先高后低的动态变化。但目前鲜见HCC患者血清miRNA-200c表达变化的报道。

研究证实，与肿瘤有关的miRNA来源于肿瘤组织，并非来源于血细胞，但可在血液中稳定存在。故血清miRNA水平可反映其在肿瘤组织中的表达情况[20]。相对于检测肿瘤组织，特别是晚期无法获得肿瘤组织者检测血清标本更方便[21]。本研究HCC组血清miRNA-200c相对表达量明显低于对照组，miRNA-200c低表达与肿瘤直径、TNM分期有关，提示其表达下调可能参与了HCC的发生、发展以及侵袭、转移过程。miRNA-200c高表达者平均生存时间长于miRNA-200c低表达者，提示miRNA-200c表达水平可反映病情的严重程度并预测生存期。

综上所述，HCC患者血清miRNA-200c表达下调，其表达变化与肿瘤直径、TNM分期及患者预后有关，有望成为诊断HCC的分子生物标志物和特异性治疗靶点。

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河北省医学科学研究重点课题计划项目(20150627)。

马丽霞(E-mail： malixia518@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.08.021

R735.7

B

1002-266X(2017)08-0067-03

2016-08-23)