曲妥珠单抗的高效液相色谱定量分析

张亚琴　王东伟

【摘 要】本文采用高效液相色谱法以磷酸盐缓冲液为流动相，凝胶柱和紫外检测器定量分析曲妥珠单抗注射液中曲妥珠单抗的药物含量。结果表明曲妥珠单抗注射液浓度在10μg/mL～1mg/mL范围内浓度与紫外吸收峰面积呈良好的线性关系，线性相关系数r≥ 0.99。

【关键词】高效液相色谱；曲妥珠单抗；定量分析

曲妥珠单抗是一种重组DNA衍生的人源化单克隆抗体，选择性地作用于人表皮生长因子受体-2（HER2）的细胞外部位。此抗体属IgGl型，含人的框架区，及能与HER-2结合的鼠抗-p185 HER2抗体的互补决定区。本文所用的药物为锆89标记的曲妥珠单抗。

本文采用的是外标法定量分析锆89标记的曲妥珠单抗注射液中曲妥珠单抗的药物含量，已达到能基本了解注射入动物体内时的药物含量。外标法操作简单快键，影响其实验结果的主要因素是进样量的误差对最终结果影响较大。

1 试剂和仪器

2 实验方法

2.1 流动相配制

分别用电子天平称取11.50g磷酸氢二钠，2.96g磷酸二氢钠，11.60g氯化钠于1L的溶剂瓶中。用量筒量取1L超纯水于瓶中，超声震荡并搅拌溶解。用抽滤装置除去其中的颗粒状杂质。

2.2 标准液配制

用电子天平精确称量1mg的曲妥珠单抗于西林瓶中，用移液枪移取1mL超纯水于西林瓶中，涡旋混匀器震荡溶解配制为1mg/mL的标准液标注为1号标准液。用移液枪移取500μL上述标准液于另一个西林瓶中，再加入500μL超纯水稀释为500μg/mL的标准液，标注为2号标准液。按上述方法逐次稀释分别配制250μg/mL、100μg/mL、10μg/mL标准液，分别标注为3、4、5号标准液。

2.3 HPLC的工作条件

流速为0.8mL/min，流动相为已配置的磷酸缓冲液。

检测波长为280nm，进样量30μL。

3 实验结果

3.1 标准品HPLC数据

3.2 标准曲线

以标准液浓度为横坐标，以紫外吸收峰面积为纵坐标建立标准曲线。如下图1所示，浓度与峰面积呈线性关系，标准曲线方程为y=3422x+4246.1，相关系数R2=0.9952。

3.3 未知样品的浓度

未知样品的色谱图如图2所示，样品的保留时间为11.910min，峰面积为708269。根据标准曲线方程计算位置样品浓度x=（y-4246.1）/3422，最终计算结果为未知样品浓度x=205.73μg/mL。

4 结果与讨论

外标法建立标准曲线方程从而计算得出未知样品的浓度是定量分析中一种常用的方法。但是也有很多的缺点和不足，其受到操作误差的影响较大，进样量以及柱效都對最终结果有很大的影响。

由标准液中浓度为10μg/mL的5号标准液的紫外吸收峰面积与标准曲线方程计算得到的紫外吸收峰面积的y值相比较，差距很明显。再比较1号标准液和标准曲线方程计算值之间的差距，由此可以得出在越低浓度的情况下，标准曲线方程的精确度受到操作误差的影响就越大。

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[责任编辑：田吉捷]