顶空—气相色谱法测定食品中亚硝酸盐

何 浩 陈幸莺 孙映球 赵 娟

(湘潭市食品药品检验所，湖南 湘潭 411100)

顶空—气相色谱法测定食品中亚硝酸盐

何 浩 陈幸莺 孙映球 赵 娟

(湘潭市食品药品检验所，湖南 湘潭 411100)

对顶空—气相色谱测定饮用水、烟笋、外婆菜和烤耳尖中亚硝酸含量进行研究，建立亚硝酸盐的快速、准确、定量检测方法，对该方法的反应机理进行推断，并用顶空—气质联用仪对反应产物进行验证。烟笋、外婆菜和烤耳尖经粉碎、沸水提取、沉淀剂沉淀和过滤后，取样品溶液分析，饮用水直接取样分析。样品处理液中先后加入环己基氨基磺酸钠溶液和硫酸溶液，在顶空瓶中50℃条件下发生重氮化反应，以衍生产物环己烯作为目标产物，定量分析。结果表明，低浓度标准物质标准曲线r2为0.999 0，取样量为5 mL时，对应的检测范围为0.001～0.200 mg/L；高浓度标准物质标准曲线r2为0.999 5，取样量为3 g时，对应的检测范围为0.67～167.00 mg/kg。该方法检出限低，线性范围宽，重复性和回收率好，是快速检测食品中亚硝酸盐较好的方法。

亚硝酸盐；顶空；气相色谱；气质联用；反应机理；环己烯

亚硝酸盐广泛存在于环境中，是食品工业中最常用的护色剂和防腐剂之一，可与肉品中的肌红蛋白反应生成玫瑰色亚硝基肌红蛋白，增进肉的色泽，还具有改善肉的风味和防腐的作用，防止肉毒梭菌的生长和延长肉制品的货架期[1]267。但过量的亚硝酸钠会致癌。亚硝酸钠在烹调和消化过程中会和食物中的胺反应，产生致癌物质亚硝胺类化合物[1]268。GB 2760—2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》规定，普通肉制品类亚硝酸盐残留量(以NaNO2计)≤30 mg/kg，肉罐头类≤50 mg/kg，西式火腿≤70 mg/kg，其他食品中不得添加。泡菜及变质的蔬菜中化学物质也可转化成为亚硝酸盐。食品和饮用水中亚硝酸盐并不一定是人工添加的，因为食品在加工和存放过程中也会生成亚硝酸盐[1]267-268。目前，检测食品中亚硝酸盐的方法主要有分光光度法[2]、离子色谱法[3-4]、气相色谱法(ECD检测器)[5]、顶空—气相色谱法(FID检测器)[6-9]、顶空—气质联用法[10]等。本试验拟探讨顶空—气相色谱(FID检测器)检测食品和包装饮用水中亚硝酸盐，在前人研究的基础上[6-9]改进样品前处理步骤，并对试验过程进行优化和改进，建立饮用水和其它复杂基质食品中亚硝酸盐的测定都适用的方法。本试验对反应机理进行预测，并用顶空—气质联用仪对反应产物进行验证，为检测各种食品基质中亚硝酸盐提供一种快速、灵敏、准确的方法。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

亚硝酸钠：分析纯，天津市大茂化学试剂厂；

四硼酸钠(硼砂)：分析纯，天津市永大化学试剂有限公司；

亚铁氰化钾：分析纯，天津市光复科技发展有限公司；

二水乙酸锌：分析纯，西陇化工股份有限公司；

环己基氨基磺酸钠：化学纯，≥98.0%，天津市光复精细化工研究所；

浓硫酸：分析纯，湖南省株洲市化学工业研究所；

DB-1石英毛细管柱：15.0 m×0.53 mm，0.50 μm，美国安捷伦科技有限公司；

HP-5MS石英毛细管柱：30 m×0.32 mm，0.25 μm，美国安捷伦科技有限公司；

高纯氮气：纯度≥99.999%，湖南湘钢梅塞尔气体产品有限公司金阳分公司；

高纯氦气：纯度≥99.999%，广州市恒源气体有限公司。

1.2 仪器与设备

顶空进样器：HSS86.50 plus型，意大利DANI公司；

气相色谱仪：GC2010plus型，配FID检测器，日本岛津公司；

全自动空气源：SPB-3型，北京中惠普分析技术研究所；

空气发生器：SPH-300型，北京中惠普分析技术研究所；

顶空—气相色谱—质谱联用仪：7697A-7890A-5975C型，配NIST 11谱库，美国安捷伦公司；

电子天平：ATY224型，日本岛津公司。

1.3 试验方法

1.3.1 标准物质和主要溶液的配制 准确称取0.062 5 g于110℃干燥至恒重的亚硝酸钠，加水溶解后移入250 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀，配成浓度为250.0 μg/mL的亚硝酸钠标准储备液A。将亚硝酸钠标准储备液分别逐级稀释到5.0，0.5，0.05 μg/mL，作为标准使用液B、C、D。标准储备液置于4℃的冰箱中可保存2个月，标准使用液B、C、D现配现用。乙酸锌溶液：220 g/L，每1 000 mL中加入30 mL 冰乙酸；亚铁氰化钾溶液：106 g/L；饱和硼砂溶液。

1.3.2 样品前处理 将固体样品用匀浆机打碎，称取3 g(精确至0.000 1 g)样品至100 mL试管中，加入5.0 mL饱和硼砂溶液，摇匀，加入60 mL 70℃的热水，在沸水浴中加热15 min，冷却至室温。在提取液中加入2.0 mL亚铁氰化钾溶液，摇匀后加入2.0 mL乙酸锌溶液，摇匀，定容至刻度后摇匀，静置30 min，备用。上清液用滤纸过滤，弃去10.0 mL初始滤液，滤液备用。

液体样品(包括含酒精或二氧化碳的饮料和饮用水)可直接取样5.0 mL至顶空瓶中分析。

1.3.3 顶空方法 加热箱温度50℃，定量环温度55℃，传输线温度60℃，GC循环时间11.0 min，样品瓶平衡时间30.0 min，定量阀体积1.0 mL。

1.3.4 气相色谱参数

(1) 柱箱升温程序：80℃(保持1 min)，40℃/min升温到100℃(保持2 min)，40℃/min升温到200℃(保持2 min)，共8 min。

(2) 其他色谱参数：气化室温度150.0℃，FID检测器温度300.0℃，载气为高纯氮气，氢气流量40.0 mL/min，空气流量400.0 mL/min，色谱柱流量1.99 mL/min，尾吹气流量30.0 mL/min，分流比20∶1。

1.3.5 气质联用仪参数

(1) 柱箱升温程序：80℃(保持1 min)，25℃/min升温到155℃(保持6 min)，共10 min。

(2) 其他色谱和质谱参数：气化室温度150.0℃，载气为高纯氦气，色谱柱流量1.0 mL/min，分流比100∶1，气质接口温度280℃，离子源温度230℃，四级杆温度150℃，EI能量70 eV，溶剂延迟时间0.0 min，扫描方式为全扫描，扫描质量数30～250 amu。

1.3.6 亚硝酸盐的测定 向8个顶空瓶中分别加入0.0，0.1，0.2，0.5，1.0，5.0 mL标准使用液D和1.0，2.0 mL标准使用液C(相当于0.000，0.005，0.010，0.025，0.050，0.25，0.500，1.000 μg亚硝酸钠)，补齐水至5 mL，加入1.0 mL 10 mg/mL 环己基氨基磺酸钠溶液，摇匀放置2 min，加入1.0 mL 100 g/L硫酸溶液，迅速压紧瓶盖，摇匀，上机。以亚硝酸钠与环己基氨基磺酸钠的衍生产物环己烯作为目标物质，绘制低浓度标准曲线，该曲线适应于纯净水和矿泉水中亚硝酸盐的检测。

向6个顶空瓶中分别加入0.0，0.1，0.2，1.0，2.0，3.0 mL标准使用液B(相当于0.0，0.5，1.0，5.0，10.0，15.0 μg亚硝酸钠)，其他步骤同低浓度标准曲线。绘制成高浓度标准曲线，该曲线适应于其他食品中亚硝酸盐的检测。

向顶空瓶中加入5.0 mL 1.3.2样品处理滤液或液体样品，其他步骤同低浓度标准曲线，上机检测。

2 结果与分析

2.1 顶空—气相色谱试验结果

0.5 μg亚硝酸钠标准物质、饮用水、烤耳尖气相色谱图分别见图1～3。以亚硝酸钠进样量(μg)为横坐标，以峰面积为纵坐标，分别绘制低浓度和高浓度标准曲线，见图4～5，低浓度标准曲线中峰面积为扣除去离子水作为空白的峰面积值。亚硝酸盐衍生产物保留时间为1.750 min。低浓度标准曲线适合于纯净水和矿泉水中亚硝酸盐的检测，线性方程为：y=11 149x+377.8，r2为0.999 0，取样量为5.0 mL时，对应的检测范围为0.001～0.200 mg/L。高浓度标准曲线适合于其他食品中亚硝酸盐的检测，线性方程为：y=11 417x+3 623.7，r2为0.999 5，称样量为3 g时，对应的检测范围为0.67～167.00 mg/kg。

图1 0.5 μg亚硝酸盐标准物质气相色谱图Figure 1 Gas chromatogram of 0.5 μg nitrite standard substance

图2 饮用水中亚硝酸盐气相色谱图Figure 2 Gas chromatogram of nitrite in drinking water

图3 烤耳尖中亚硝酸盐气相色谱图Figure 3 Gas chromatogram of nitrite in roasted ear tip

图4 低浓度标准物质标准曲线(以NaNO2计)Figure 4 Standard curve of low concentration (evaluated by NaNO2)

图5 高浓度标准物质标准曲线(以NaNO2计)Figure 5 Standard curve of high concentration (evaluated by NaNO2)

2.2 顶空—气质联用仪验证结果

用顶空—气质联用仪对亚硝酸盐标准物质衍生物进行分析，总离子流图见图6，主要衍生产物的出峰时间为1.642 min，用Nist 11谱库对其进行检索，证实了该反应产物为环己烯，其特征离子为m/z=54，67，82，质谱图见图7。环己基亚硝酸酯的特征离子为m/z=57，82，98，对亚硝酸盐衍生物提取这3个特征离子未发现特征峰。证实了顶空气相反应的原理为亚硝酸钠和环己基氨基磺酸钠在酸性条件、常温状态下重氮化反应生成环己烯，在50℃顶空瓶中，环己烯挥发到顶空瓶上方气体相部分。GB 5009.97—2003《食品中环己基氨基磺酸钠的测定》中表明，亚硝酸钠和环己基氨基磺酸钠在酸性、冰浴条件下生成环己基亚硝酸酯，有学者[7]便因此认为顶空条件下反应产物也为环己基亚硝酸酯，未考虑反应温度的不同会导致反应机理和反应产物不同。

图6 亚硝酸盐总离子流图Figure 6 Total ion current of nitrite

图7 亚硝酸盐衍生物提取离子质谱图Figure 7 Extraction ion mass spectrometry of nitrite derivative

2.3 回收率、精密度、准确度与检出限

回收率与相对标准偏差见表1。以国标方法测量值作为真值，则本方法测量值与真值的偏差见表2，分别为9.4%，8.7%与5.6%。本方法的回收率、精密度与准确度均符合GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范 食品理化检验》附录F要求。以3倍信噪比计算检出限，以10倍性噪比计算定量限，纯净水、矿泉水的检出限为0.000 3 mg/L，定量限为0.001 6 mg/L；其他食品的检出限为0.1 mg/kg，定量限为0.33 mg/kg，均优于GB 5009.33—2010检测方法。

表1 相对标准偏差和加标回收率Table 1 Relative standard deviation and recovery rate (n=6)

表2 不同方法计算得到的样品中亚硝酸盐含量Table 2 The content of nitrite in the samples obtained by different methods (n=6)

2.4 试验分析

2.4.1 GB/T 5009.33—2010和本方法回收率均偏低的原因分析 食品中亚硝酸盐含量的测定(分光光度法)是一个比较成熟的方法，但本研究发现，回收率在86.9%～89.2%，当试验过程控制不好时，甚至更低。本方法回收率也不高，为90.7%～91.9%，主要原因是样品前处理过程的损失：① 样品在煮沸提取和沉淀剂沉淀蛋白质时，将导致一定的损失；② 研究发现滤纸的使用会干扰硝酸盐和亚硝酸盐的测定，导致结果严重偏离[11]；③ 各个试剂的添加顺序和添加后的平衡时间不固定造成的影响。

2.4.2 试验用水的选择和峰面积处理 对自来水、实验室自制去离子水和市场上3个大品牌纯净水进行试验发现，气相色谱中均有较大的环己烯色谱峰，说明这些水中均存在着亚硝酸盐，本试验选用实验室自制去离子水作为试验用水。绘制低浓度标准曲线时，标准物质的峰面积均为扣掉空白水峰面积后的值。而肉制品、蔬菜制品等前处理过程中均用到实验室用去离子水，因此标准物质的峰面积未扣除空白水的峰面积值。

2.4.3 其他注意事项 应注意顶空和气相色谱仪的维护，防止水对顶空进样系统和石英毛细管色谱柱的损坏。试验表明，当顶空进样器和气相色谱连续进样50次以上未维护时，环己烯的峰形和重复性变差。应在连续进样20次后，将顶空进样器的炉温、定量环和传输线在130℃老化2 h以上，将色谱柱在最高耐受温度下老化0.5～1.0 h。

3 结论

本试验研究了顶空—气相色谱(FID检测器)测定饮用水、烟笋、外婆菜和烤耳尖中亚硝酸盐的方法。本试验优化了样品前处理步骤，对试验过程中影响加标回收率的因素进行分析。包装饮用水和其他复杂基质食品分别采用不同的线性方程进行分析。与GB/T 5009.33—2010相比，本方法前处理简单，灵敏度高，分析不受样品溶液颜色的影响，且回收率、精密度、准确度均能达到实验室质量控制规范(GB/T 27404—2008)要求，检出限明显优于GB/T 5009.33—2010。用顶空—气质联用仪对反应产物进行分析，发现该试验主产物为环己烯，而不是一些研究人员[7]推断的环己基亚硝酸酯。

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Determination of nitrite in food by using headspace-gas chromatography

HE HaoCHENXing-yingSUNYing-qiuZHAOJuan

(XiangtanInstituteforFoodandDrugControl,Xiangtan,Hunan411100,China)

The determination of nitrite content in drinking water, smoked bamboo shoot, grandmother food and roasted ear tip was studied by using headspace-gas chromatography, and a fast, accurate and quantitative detection method of nitrite was established. The reaction mechanism of this method was deduced, and the relative products were validated by the headspace gas chromatography-mass spectrometry. The sample solution of smoked bamboo shoot, grandmother food and roasted ear tip were analyzed after crushing, boiling water extraction, precipitation and filtration, and then sodium cyclamate and sulfuric acid solution were added to pretreated sample. Diazo reaction was reacted in headspace bottle at 50℃, using the derivatives of cyclohexene as the target product and quantitative analysis. In this paper, the low concentration standard material standard curver2was 0.999 0. Moreover, the corresponding detection range was 0.001 ～ 0.200 mg/L when 5 mL sample was used. However, the high concentration standard material standard curver2was 0.999 5, and the corresponding detection range was 0.67～167.00 mg/kg while was 3 g sample was used. It was verified to be a good method for the detection of nitrite in food, with low detection limit, wide linear range, and good repeatability and recovery rate.

nitrite; headspace; gas chromatography; gas chromatography-mass spectrometer; reaction mechanism; cyclohexene

何浩(1986—)，男，湘潭市食品药品检验所工程师，硕士。E-mail: 710754686@qq.com

2017—01—05

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.01.012