雷公藤多甙对致痫大鼠学习记忆及海马Ng和PKC表达的影响

黄 灵， 黄建敏， 李雪斌， 黄瑞雅， 蒙兰青

雷公藤多甙对致痫大鼠学习记忆及海马Ng和PKC表达的影响

黄 灵， 黄建敏， 李雪斌， 黄瑞雅， 蒙兰青

目的 研究雷公藤多甙(TWP)在戊四氮(PTZ)所致癫痫大鼠学习记忆障碍中的干预作用及可能机制,探讨神经颗粒素(Ng)和蛋白激酶C(PKC)在癫痫大鼠海马组织中的表达的影响。方法 通过水迷宫及Y迷宫筛选方式挑选学习记忆功能正常的SD大鼠90只，随机分为PTZ致痫组、TWP低剂量组(TWP1)、TWP高剂量组(TWP2)、正常对照组，采用戊四氮(PTZ)腹腔注射慢性点燃癫痫。用水迷宫和Y迷宫对4组大鼠进行学习记忆能力检测，运用实时荧光定量PCR及酶联免疫吸附法分别检测其海马组织Ng和PKC基因mRNA及相应蛋白的表达水平。结果 与PTZ组相比，TWP干预组大鼠在水迷宫中提高，其学习记忆能力接近NC组(P>0.05)；而4组逃避潜伏期差异无统计学意义(P> 0.05)。在Y迷宫TWP干预组错误反应次数比PTZ组明显减少(P<0.05)，其行为能力接近NC组(P> 0.05)；但4组在全天总反应时间上的差异无统计学意义(P>0.05)。经TWP干预后大鼠海马Ng和PKC基因mRNA及相应蛋白的表达上调，与PTZ组比较，差异具有统计学意义(P<0.05)，上调水平与NC组接近(P> 0.05)；而TWP1和TWP2两组之间的差异无统计学意义(P>0.05)。结论 TWP可有效改善PTZ所致癫痫大鼠的学习记忆能力，这与上调大鼠海马组织Ng及PKC表达水平密切相关。

戊四氮； 癫痫； 神经颗粒素； 蛋白激酶C； 雷公藤多甙

反复癫痫发作患者常伴有学习及记忆能力等认知功能的障碍，严重的影响了生活质量。因此，研究反复癫痫发作致学习记忆障碍的发病机制和探索治疗癫痫的新药物及新方法成为目前癫痫研究中的热点。Ng作为PKC磷酸化功能的作用底物，参与信号转导、改变突触可塑性并在学习记忆过程中发挥重要调控作用[1]。20世纪70年代以后，雷公藤多甙具有较强的抗炎、免疫抑制作用，且能通过血脑屏障，已成功用于类风湿性关节炎、红斑狼疮等自身免疫性炎症性疾病,且已广泛应用于临床，获得了良好的疗效，引起国内外医药界的高度重视[2]。目前关于雷公藤多甙干预癫痫大鼠的学习记忆是否有效尚未见报道。本实验拟雷公藤多甙在戊四氮所致癫痫大鼠学习记忆障碍中的干预作用及可能机制,及探讨Ng和PKC在癫痫大鼠海马组织中的表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 动物 清洁级雄性SD大鼠(n=105)购自广西医科大学实验动物中心，大鼠鼠龄为3个月，SPF等级，平均体重为(200±10)g，分笼饲养，条件为：12 hrs光亮/黑暗条件、20 ℃～25 ℃环境温度。

1.1.2 主要试剂及仪器 雷公藤多甙(浙江得恩制药有限公司)、DNTP(大连宝生物Takara)、引物(大连宝生物Takara)、总RNA抽提试剂盒(天根生化科技有限公司)、大鼠蛋白激酶C(PKC)试剂盒(武汉华美生物工程工程有限公司)、神经颗粒素(Ng)试剂盒 (武汉华美生物工程工程有限公司)、实时荧光定量PCR仪(美国ABI 7500)、紫外分光光度计(美国BIO-Rad)、Morris水迷宫(参照宿宝贵实验自制)、Y迷宫(张家港市生物医学仪器厂)等。

1.2 方 法

1.2.1 实验动物分组及制备动物模型 挑选经水迷宫和Y迷宫实验合格的大鼠90只进入研究，将所选取的大鼠机随分为4组：PTZ致痫组(PTZ组，n=25)、TWP低剂量组(TWP1组，n=25)、TWP高剂量组(TWP2组，n=25)及正常对照组(NC组，n=15)，其中前3组为癫痫模型，采用PTZ腹腔注射方式诱导，剂量为35 mg/kg·d，每日晨8：00-9：00一次性给药，连续用药28 d；在3组癫痫模型中，TWP1和TWP2组接受TWP干预处理，即在PTZ给药前30 min，分别给予10 mol/kg·d和30 mmol/kg·d TWP(融于羧甲基纤维素钠)进行灌胃处理，共用28次。而NC组为非癫痫模型，仅进行生理盐水处理，剂量与给药方式同癫痫模型组PTZ。

观察所有大鼠在每次注射给药后1 h内的行为变化。根据Racine分级标准将其行为分为6级，具体如下：0级，无任何反应，呈正常的行为状态；Ⅰ级，湿狗样抖动、面肌痉挛如眨眼、动须及节律性咀嚼；Ⅱ级，颈部肌肉痉挛表现为点头和(或)甩尾；Ⅲ级，一侧前肢阵挛；Ⅳ级，双侧前肢阵挛伴站立；Ⅴ级，全身阵挛，失去平衡，跌倒。在第29～33天和第34～35天，实验动物相继进行水迷宫及Y迷宫测试以分析学习记忆能力；在第36天，通过手术取实验动物的海马组织以检测和分析Ng与PKC的基因及蛋白表达情况。

1.2.2 实时荧光定量PCR检测Ng和PKC mRNA的表达水平 用Trizol提取大鼠海马组织的总RNA,紫外分光光度计测定RNA浓度，用逆转录试剂盒将RNA逆转录合成cDNA。 再以SYBR Green体系为荧光标记物，在实时荧光定量PCR仪上进行PCR扩增反应。以β肌动蛋白(β-action)为内参照mRNA。PKC上游引物5’-AAATCCGGGCTCCCACATC-3’,下游引物5’-CGGGATGAGCTTCAGTTTCACATA-3’,扩增片段116 bp；Ng上游引物5’-CCTGAACTACCACCCAGCATTG-3’，下游引物5’-TAGAATATCGTCGTCTGGCTTGGA-3’，扩增片段134 bp。50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min预变性后，95 ℃ 15 s 和60 ℃ 60 s共40个循环。用2-△△CT法进行相对定量分析。

1.2.3 ELISA法检测Ng和PKC的蛋白表达水平 取海马组织称重，把海马组织剪切成细小的碎片，严格按照ELISA试剂盒说明书步骤检测Ng和PKC的蛋白的表达。

2 结 果

2.1 水迷宫实验检测结果 在5个训练日中各组平均潜伏期的差异并无统计学意义(P>0.05)，PTZ组大鼠的平均运行时间较NC组显著延长(P<0.05)，而正确率却明显降低(P<0.05)，说明癫痫致使大鼠学习记忆能力显著受损。在给予TWP干预处理后，癫痫大鼠运行时间出现缩短(P<0.05)，而正确率提高(P<0.05)，但这种作用无剂量依赖关系(P>0.05)(见表1)。

2.2 Y迷宫实验检测结果 PTZ组大鼠的错误反应次数与NC组比较明显升高(P<0.05)；TWP1组和TWP2组的错误反应次数与PTZ组比较明显下降(P<0.05)，TWP1组和TWP2组与NC组比较无显著性差异(P>0.05)；TWP1组和TWP2组也无显著性差异(P>0.05)。全天总反应时间(total reaction time,TRT)4组分别为：4组比较无显著性差异(P>0.05)。结果提示癫痫大鼠的记忆成绩降低，雷公藤多甙可以改善其学习记忆成绩(见表2)。

2.3 各组大鼠海马内NgmRNA、PKC mRNA的表达 与NC组比较，PTZ组Ng与PKC基因的mRNA表达下调，但当给予TWP干扰处理后，Ng与PKC表达开始回升约50%～70%，接近正常，值得注意的是我们并没发现TWP对PKC基因的mRNA表达调控的剂量依赖性(P>0.05)(见表3、表4)。

2.4 大鼠海马Ng与PKC蛋白表达检测结果 PTZ组较对照组Ng与PKC蛋白表达下调，在加入TWP后蛋白表达出现回调达1.5～1.7倍(P<0.05)，但TWP的上调Ng与PKC作用无剂量依赖性(P>0.05)(见表5)。

表1 水迷宫实验平均逃避潜伏期、平均运行时间、正确率的比较(±s)

与NC组比较*P<0.05；TWP1及TWP2与PTZ组比较#P<0.05

表2 大鼠错误反应次数和全天总反应时间(±s)

与NC组比较*P<0.05；TWP1及TWP2与PTZ组比较#P<0.05

表3 各组大鼠海马内NgmRNA的相对含量比较(±s)

与NC组比较*P<0.05；TWP1及TWP2组与PTZ组比较#P<0.05

表4 各组大鼠海马内PKC mRNA的相对含量比较(±s)

与NC组比较*P<0.05；TWP1及TWP2组与PTZ组比较#P<0.05

表5 ELLSA检测各组Ng与PKC含量(±s)

与NC组比较*P<0.05；TWP1及TWP2组与PTZ组比较#P<0.05

3 讨 论

雷公藤多甙是从中药雷公藤的根芯部分提取的有效成分，其主要含有雷公藤内酯二醇(T8)、雷醇内酯(T9)、雷公藤红素及雷公藤氯内酯醇(T4)，雷公藤多甙在保留了雷公藤生药疗效的同时安全性提高了一倍以上[3]。近年来，对雷公藤多甙的研究中，发现其可能具有改善学习记忆的作用。施丽艳等[4]发现在AD大鼠模型中，雷公藤红素对认知功能障碍具有明显的保护作用。另外，研究已证实雷公藤多甙具有对神经系统损害的毒副作用，如抽搐和烦躁等。它的毒副作用的发生与损害的严重程度与雷公藤多甙提取物的剂量相关。鲍育华等[5]研究显示,雷公藤红素在60 μg/kg时具有神经元保护作用,能够改善手术创伤刺激引发的老年鼠认知功能的降低。关于雷公藤提取物对神经系统直接的毒理学研究目前尚无报道。但余昌胤[6]等研究发现雷公藤多甙能改善慢性脑低灌注大鼠学习记忆能力，这种作用在高剂量和低剂量间差异无显著性意义。本实验采用检测学习记忆的理想方法水迷宫和Y迷宫，分别从空间学习记忆和逃避性记忆对大鼠进行行为学检测，结果表明在水迷宫中PTZ致痫组的学习记忆受损表现为运行时间延长、错误次数增加，TWP1和TWP1较PTZ组运行时间缩短、错误次数减少，TWP1、TWP1之间无显著性差异；在Y迷宫实验中PTZ致痫组错误反应次数增多，雷公藤多甙干预各组较PTZ致痫组减少，TWP1和TWP1之间无明显差异。行为学测试说明结果戊四氮点燃慢性癫痫大鼠确实存在空间学习记忆功能障碍，雷公藤多甙对大鼠脑组织损伤所造成的学习记忆障碍有保护作用，雷公藤多甙两种剂量干预效果一致，其机制有待进一步研究。

Ng是神经元特异性的突触后膜蛋白,在大脑内表达丰富，广泛分布于海马、前额皮质、纹状体和杏仁核等重要脑区，这些部位是学习和记忆功能重要的脑结构基础。Ng基因敲除小鼠在健康状态、神经反射、感觉和运动方面表现正常，但在学习、记忆及PKC细胞信号系统等方面明显受损[7]。徐天勇等[8]发现慢性应激致使皮质、海马、下丘脑神经元细胞Ng蛋白含量下降，进而致使神经元细胞数量减少伴突棘数量减少，突触可塑性的损害造成大鼠水迷宫实验潜伏期延长，外显为学习记忆能力的降低。

蛋白激酶C是一组具有单一肽链结构的丝氨酸苏氨酸蛋白激酶，是机体细胞信号传导通路的中心环节，它广泛分布于哺乳动物各种组织中，其中以脑组织中含量最丰富[9]。PKC家族调节细胞增殖分化、神经发生和中枢神经系统发育等一系列过程，己经证实其在突触可塑性、长时程记忆增强和长时程记忆减低过程中起重要作用[10]。Ng与PKC有密切的关系。Ng作为PKC的天然作用底物，生理状态下，Ng与CaM结合形成复合体，当神经冲动引起NMDAR活化，使与受体偶联的Ca2+通道开放时，细胞内Ca2+浓度升高，Ng与CaM复合体解离，游离的Ng被PKC磷酸化，磷酸化的Ng与CaM的亲和力降低，使细胞内的Ca2+与CaM复合体浓度增加，进而激活Ca2+和CaM依赖性酶，如CaMKII等，而这些酶大都参与LTP的诱导和维持[11]。

我们用实时荧光定量PCR及酶联免疫吸附试验(ELISA)的方法，从观察癫痫后海马Ng及PKC的mRNA和蛋白表达变化入手，结果发现癫痫后PTZ组海马区Ng和PKC的mRNA水平下降，蛋白表达减少，Ng的结果与国内研究一致[12]。推测癫痫发作后导致缺血、缺氧、水肿以及兴奋性氨基酸毒性等，钙泵功能受损，不能泵出胞浆内过多Ca2+，导致神经元钙超载。钙超载在癫痫脑损伤中起着关键性作用[13]，病理状态下细胞内钙超载可造成一系列代谢紊乱[14]。钙稳态的失衡导致PKC的活性降低，PKC的水平也降低，使Ng的磷酸化和去磷酸化失衡，胞内游离CaM减少，进而影响CaM与Ca2+的结合，这样也影响了包括LTP形成的重要蛋白激酶-CaMKⅡ；Ng表达的降低也影响了与之结合的CaM，CaMKⅡ的活性也可能受到影响；而CaMKⅡ的表达降低会直接影响CaMKⅡ的活性。由此推测这些因素有可能引起CaMKⅡ的活性下降，抑制了LTP的形成，从而造成学习记忆功能的障碍。为更深入了解雷公藤多甙对Ng和PKC基因的mRNA和蛋白表达调控的有无剂量依赖性，本实验用雷公藤多甙干预癫痫大鼠采用低剂[10 mmol/(kg·d)]和高剂量[30mmol/(kg·d)]两种剂量。结果显示TWP1和TWP2 Ng和PKC的mRNA及蛋白表达较PTZ组升高，有统计学意义，但在TWP1组和TWP2组间差异无显著性意义，且水平接近NC组。推测其机制可能是雷公藤多甙降低TNF-α、核转录因子(NF-κB)的释放，阻止钙超载，保护海马[Ca2+]i水平，增强Ng和PKC的mRNA及蛋白表达水平，LTP得以形成，促进学习记忆功能好转。本实验发现TWP1组和TWP2组大鼠的Ng和PKC的mRNA及蛋白表达差异无显著性，推测雷公藤多甙10 mmol/(kg·d)已达到改善癫痫大鼠学习记忆能力的最大剂量。观察其治疗效果，探讨雷公藤多甙改善癫痫大鼠学习记忆能力的最佳有效剂量，并进一步完善相关作用机制的研究，为雷公藤多甙治疗反复癫痫后认知功能障碍提供理论基础。另外，实验中观察到，TWP1组和TWP2组并不能抑制癫痫大鼠的发作，且高剂量组大鼠癫痫发作数较低剂量高，推测这可能与雷公藤多甙的神经系统毒副作用有关，也说明雷公藤多甙10 mmol/(kg·d)已达到改善癫痫大鼠学习记忆能力的最大剂量。

綜上所述，雷公藤多甙对改善癫痫所致学习记忆能力的障碍具有一定的防治作用，其机制可能雷公藤多甙与增强Ng和PKC的mRNA及蛋白表达水平，LTP得以形成，进而促进学习记忆能力好转。

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Tripterygium Wilfordii Polyglycoside:Effects on the learning and memory of rats with epileptisy and the expression of neurogranin and Protein Kinase C

HUANGLing,HUANGJianmin,LIXuebin,etal.

(DepartmentofInternalNeurology,AffiliatedHospitalOfYoujiangMedicalUniwersityForNationalities,Guangxi533000,China)

Objective To investigate the roles of Tripterygium Wilfordii Polyglycoside (TWP) in the learning and memory of rats having epileptisy induced by pentylenetetrazole (PTZ) and the effects of Neurogranin (Ng) and Protein Kinase C (PKC) expression and to explore the possible association among TWP,PTZ,and epileptisy.Methods Through the water maze and Y maze were selected with normal learning and memory function of 90 SD rats were randomly divided into PTZ group,TWP of epilepsy induced by low dose group(TWP1),high dose of TWP group(TWP2) and normal control group,and with four nitrogen (PTZ) by intraperitoneal injection of chronic model epilepsy.Water maze and Y maze learning and memory ability of detection of 4 groups of rats by using real-time fluorescence quantitative PCR and enzyme-linked immunosorbent assay for the expression levels of Ng and PKC gene mRNA in the hippocampus and the corresponding protein were detected respectively.Results Compared with the PTZ group,the rats in the TWP intervention group improved their learning and memory ability close to the NC group (P>0.05),while the groups had no significant difference between the four groups(P>0.05).In the Y maze,the TWP intervention group was significantly less than the PTZ group (P<0.05),and its behavioral ability was close to the NC group (P>0.05),but the difference was not statistically significant (P>0.05) in the total response time of the four groups.The expression of Ng and mRNA in hippocampus of rat PKC gene and corresponding protein TWP after the intervention,compared with PTZ group,the difference was statistically significant (P<0.05),raised the level and close to group NC (P>0.05);while there was no significant difference in TWP1 and TWP2 between the two groups (P>0.05).Conclusion These results suggested that TWP might be able to effectveily improve the learning and memory abiligy of rats featuring epileptisy,possibly correlated with the up-regulation of Ng and PKC gene in the hippocampuse tissues.

PTZ; Epilepsy; Ng; PKC; TWP

1003-2754(2017)02-0122-04

2016-10-11；

2016-11-28

国家自然科学基金项目(No. 81160165)；右江民族医学院院级课题(No.200958);广西桂西高发病防治研究重点实验室项目资助(桂教科研2014)6号；广西临床重点专科项目资助(桂教科研2013)16号

(右江民族医学院附属医院神经内科，广西 百色 533000)

黄建敏，E-mail：bshuangjianmin@126.com

R742.1

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