CaO/ZnO核-壳结构纳米材料抗菌性能的初步研究

王丽丽 孙源卿 张颖丽 孙宏晨 林权 于维先 李祥伟

口腔是一个有菌环境，细菌必然影响口腔疾病的治疗效果及预后。口腔临床常用的氧化锌和氢氧化钙类材料抑菌性能较差[1],氢氧化钙材料稳定性较差，易被吸收或溶解[2]，另外，残余材料还会影响氧化锌与丁香油的螯合反应[3]而影响材料性能。因此，本研究检测CaO/ZnO核-壳结构纳米材料的抑菌性能。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

氧化锌粉、丁香油酚、(上海阿拉丁生物试剂有限公司)；iRoot根管封闭剂(贝曼科学医药有限公司，瑞士，批号：14002SP)、盐酸米诺环素软膏(Sunstar INC，日本，批号：1509041)；台式高速离心机(5810，Eppendorf，德国)；扫描电子显微镜(JEM- 6700F, JEOL,日本)；透射电子显微镜(H- 800，HITACHI，日本)；等离子体发射光谱仪(Optima 3300DV, PerkinElmer，美国)；酸度计(PB- 10，赛多利斯科学仪器有限公司，中国)；变形链球菌(标准菌株ATCC- 25135)、粪肠球菌(标准菌株ATCC- 29212)、大肠杆菌(标准菌株ATCC- 11229)、金黄色葡萄球菌(标准菌株ATCC- 25923)。

1.2 CaO/ZnO核-壳结构纳米球制备及表征检测

采用液相沉淀法制备CaO/ZnO核-壳结构纳米球，扫描电镜(SEM)观察表面形貌，透射电镜(TEM)观察球粒大小、电感耦合等离子体(inductively coupled plasma, ICP)分析其离子组成。

1.3 CaO/ZnO核-壳结构纳米球的离子释放

1.3.1 pH值检测 将制备的CaO/ZnO核-壳结构纳米材料分散于PBS(pH 7.2)中，恒温持续震荡(90 r/min)，分别在3、6、12、24、48 h时间点，将反应体系离心，取上清液5 ml，在室温条件下，测定pH，反应体系再补充等体积的新鲜PBS。

1.3.2 CaO/ZnO核-壳结构纳米材料的钙离子累积释放量测定 用上述收集的上清液作为待测样品，应用甲基麝香草酚蓝法(MTB)[4]，用紫外分光光度计测定待测试样、对照试样及标准样。再检测试样的钙浓度。钙浓度(mmol/L)=样品管吸光度/标准管吸光度×2.5

1.4 抑菌性检测

参照Morgental等[5]琼脂扩散实验，在无菌操作条件下，分别将金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、大肠杆菌和变形链球菌复苏，稀释至密度为3.0×108CFU/ml，分别将上述各细菌悬液100 μl滴于MH琼脂培养基表面，用无菌棉拭子将菌液均匀涂布至整个培养基表面。

在涂布好细菌的培养基内打孔，每个培养基内打5 个孔(孔径为5.0 mm，深为5.0 mm)，将每个孔分别放置新鲜配制的氧化锌-丁香油材料(1∶1粉/液比)、CaO/ZnO-丁香油材料(1∶1粉/液比)、iRoot SP材料，盐酸米诺环素软膏(派力奥)(阳性对照)，PBS缓冲液(阴性对照)。室温下放置2 h，再将所有培养皿在37 ℃恒温箱内培养48 h后，用游标卡尺测得抑菌环直径(是指打孔处圆心至细菌生长的最内缘之间的距离)，所有实验均做3 份。

1.5 统计学处理

2 结 果

2.1 CaO/ZnO核-壳结构纳米球的表征

CaO/ZnO核-壳结构纳米球的外观为白色粉末(图 1A)。SEM下材料颗粒为球形且分散均匀(图 1B)，TEM下可见该纳米球具有核-壳结构(图 1C)，粒径范围为80～90 nm(图 1D)。

经ICP检测可见CaO/ZnO核-壳结构纳米球材料含有2 种金属元素Ca和Zn(表 1)，这说明，制备的CaO/ZnO核-壳结构纳米球材料由ZnO和CaO组成。

A： 外观； B： SEM观察； C： TEM观察； D： 粒径分布

表 1 CaO/ZnO核-壳结构纳米球的ICP检测结果

2.2 CaO/ZnO核-壳结构纳米球材料的离子释放性

CaO/ZnO核-壳结构纳米球分散在PBS后，在不同时间点，钙离子释放和溶液pH值的变化情况见图 2。

A：Ca2+浓度变化； B： pH值变化

2.3 CaO/ZnO核-壳结构纳米球材料的抑菌性

图 3为CaO/ZnO核-壳结构纳米球抑菌性检测结果。3 种材料均能抑制细菌的生长，阴性对照组无抑菌性。CaO/ZnO核-壳结构纳米球-丁香油材料对大肠杆菌、变形链球菌和金黄色葡萄球菌所形成的抑菌环直径均较大，分别为(21.38±0.66)、(26.86±0.51)、(18.45±0.77) mm，均优于氧化锌-丁香油组及iRoot SP组(P﹤0.01)；各材料对粪肠球菌形成的抑菌环均较小，但CaO/ZnO-丁香油组对其形成的抑菌环(9.99±0.40) mm仍大于其他材料所形成的抑菌环(P﹤0.01)。CaO/ZnO-丁香油组与阳性对照组间的抑菌环大小无统计学差异(P﹥0.05)。

3 讨 论

牙体牙髓病及牙周病为口腔常见疾病，经研究证实其主要致病因素为细菌感染[6]。ZnO和Ca(OH)2是治疗该类疾病的较常用材料[7]，但是其抑菌效果较有限[1]。增强ZnO和Ca(OH)2类材料抑菌性的课题成为目前研究的热点之一。为此，本研究设计和制备了CaO/ZnO核-壳结构纳米球来提高其抑菌性能，经表征观察和相关检测，证实该材料具有优良的抑菌性和适宜的理化性质。

图 3 材料的抑菌性检测结果

本研究制备的CaO/ZnO核-壳结构纳米球的粒径范围为80～90 nm(图 1)，而根管内不同水平的牙本质小管开口直径为2.65～3.23 μm[8]，说明，本研究所制备的纳米球在颗粒尺度方面易于填入牙本质小管。

本实验选择了临床上较常应用的根管封闭剂(iRoot糊剂)和窝洞暂封材料(氧化锌-丁香油)作为对照。通过对比可见，CaO/ZnO核-壳结构纳米球材料对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和变形链球菌的抑菌性均大于iRoot及氧化锌-丁香油(P<0.01)。CaO/ZnO核-壳结构纳米球材料对粪肠球菌的抑制性较弱，但是，其抑菌效果较iRoot组和氧化锌组均较强(P<0.01)；这可能与粪肠球菌经常以生物膜的形式存在，而生物膜内的细菌对抗生素的耐药性较高有关，还可能与该菌在碱性条件下仍可继续存活的特性有关[9]，而这些特性也是许多感染细菌难以被根除的重要原因之一[10]。由此可见，CaO/ZnO核-壳结构纳米球材料具有很好的抗菌性。

研究制备的CaO/ZnO核-壳结构纳米球在PBS中可持续释放Ca2+和OH-，溶液pH值随时间的增加而升高(图 2)，pH值增高具有抑菌作用[11]，逐步释放的Ca2+及升高的pH值可促进局部组织矿化[12]，这在治疗口腔病变，特别是牙体和牙周组织疾病方面具有积极效应[13]。该材料通过升高局部pH值，改变细菌正常生长所需的酸性环境，破坏细菌蛋白质及DNA，从而产生抑菌和杀菌作用[6]；中和细菌产生的毒性代谢产物[14]，这可能是本研究所制备的CaO/ZnO核-壳结构纳米球材料具有优异抑菌性的内在机制。如将该新型材料用作根管封闭剂或其辅料，Ca2+可以与牙本质中的羟磷灰石发生反应，形成磷酸钙以封闭牙本质小管[15]；还可以激活碱性磷酸酶活性，促进根尖周组织修复和重建[12]。如将该材料用作窝洞暂封材料，Ca2+可促进脱矿牙本质的再矿化[5]。

本研究结果证实所制备的CaO/ZnO核-壳结构纳米球材料具有很好的抑菌性，可望成为治疗牙体等口腔硬组织疾病的抑菌性材料或其辅料。