赞皇枣黑腐病菌的生物学特性研究

赵晓霞++王梦亮++高芬

摘要：細极链格孢菌（Alternaria tenuissima）是引起山西石楼赞皇枣黑腐病的主要病原菌之一，对该病原菌的主要生物学特性进行了研究。采用菌丝生长速率法、血球计数板观察法和凹玻片悬滴法，研究不同培养基、碳源、氮源、温度、pH和光照对该病原菌菌丝生长、分生孢子产量以及孢子萌发的影响。Alternaria tenuissima的菌丝适宜在PDA、SCS和CZA培养基上生长，其中PDA是最佳的产孢培养基。以CZA为基础培养基时，葡萄糖和甘油为菌丝生长的最佳碳源，而无碳培养基上产孢量最大；硝酸钠为氮源时最利于菌丝生长和产孢。菌丝在24～32 ℃生长速度最快，24～28 ℃时产孢量最大；在pH 6～10范围内菌丝均能良好生长，pH 10时产孢量最大；光照对菌丝生长速率影响不明显，黑暗条件下产孢量最大。分生孢子在24 h时即可达到基本萌发，黑暗条件下28 ℃时，pH 6～7为最佳萌发条件。Alternaria tenuissima对营养利用和环境条件的适应能力较强，给赞皇枣黑腐病的防治造成了困难。

关键词：赞皇枣；黑腐病；细极链格孢菌（Alternaria tenuissima）；生物学特性

中图分类号：S436.65 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）03-0471-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.03.018

Biological Characteristics of Alternaria Tenuissima， a Pathogenic Bacteria of Black Rot on Zanhuang Jujube

ZHAO Xiao-xia， WANG Meng-Liang， GAO Fen

（Institute of Applied Chemistry， Shanxi University， Taiyuan 030006， China）

Abstract： In order to study the main biological characteristics of the major pathogenic bacteria of black rot on Zanhuang jujube（Alternaria tenuissima），the effects of the medium， the sources of nitrogen and carbon，temperature，pH and illumination under different conditions on the mycelia growth，conidial production and conidial germination of Alternaria tenuissima were studied by the mycelium growth rate，blood cell counting chamber observation and concave slide pendent drop methods. The results showed that，A. tenuissima grew well in PDA，SCS and CZA，in which PDA was the optimal medium for conidial production. When CZA was used as the basic medium，glucose and glycerin were the optimum carbon sources for mycelia growth，and the carbonless medium was the maximum producer of conidia. The sodium nitrate was the beneficial nitrogen sources for mycelia growth and conidial production. The mycelia grew at the fastest rate at 24～32 ℃ and the conidial production was the highest at 24～28 ℃. The mycelia could grow well at pH 6～10 and the conidial production was the highest at pH 10. Illumination had no significant effect on the mycelia growth rate，while darkness was proved the most favorable condition for the conidia production. Normally the conidia could germinate in 24 h，and the optimum conditions for the conidial germination of A. tenuissima were 24 h，darkness，28 ℃ and pH 6～7. A. tenuissima had strong adaptive capacity to the utilization of nutrition and environmental conditions，therefore made difficulties to the prevention and control of black rot on Zanhuang jujube.

Key words： Zanhuang jujube； black rot； Alternaria tenuissima； biological characteristics

赞皇枣（Zanhuang jujube）原产河北省赞皇县，是中国700多个枣品种中惟一的自然三倍体，素以整齐个大、皮薄肉厚盛誉天下[1]。赞皇枣在全国各地均有引种栽培，目前已是山西省的主栽优良品种之一。近年随着栽培面积的迅速发展，黑腐病的发生愈来愈重，在中国北方地区，流行年份病果率可达50%以上，重者甚至绝收[2，3]。2011-2013年，山西省石楼县赞皇枣种植区的病果率达50%～60%，致使产量和品质急剧下降，成为生产上亟待解决的难题。前期研究表明，细极链格孢菌（Alternaria tenuissima）是引起该地区赞皇枣黑腐病的主要病原菌之一[4]。本文针对该病菌的生物学特性进行系统研究，以期全面了解黑腐病的发生规律，进而为科学防治提供依据。

链格孢属（Alternaria Nees）真菌为世界性分布，具腐生、内生和致病性[5]，能侵染危害多种农作物，且作为枣果致病菌多有报道，可单独致病，也可与其他菌一起混合侵染宿主。如A. tenuissima（Fr.） Wiltshire可引起冬枣黑斑病[6]，而A. alternata（Fries） Keissler除引起壶瓶枣褐斑病[7]外，也是冬枣黑点病的致病菌之一[8]，同时，还可与Irpex lacteus、Penicillium expansum、Cladosporium tenuissimum复合侵染导致壶瓶枣缩果病[9]，与Phoma destructive Plowr、Fusicoccum sp.复合侵染导致枣铁皮病[10]。

链格孢属真菌适应性强、种级特征变异较大，其致病机理因侵染方式及所处生态环境不同又有差异，致使病害防治十分困难。了解致病菌的生物学特性有助于掌握发病规律，从而采取合理的防治措施。目前，关于链格孢菌生物学特性的研究报道较多，但不同种间呈现一定差别。例如引起新疆枣缩果病的A. alternata （Fr.）Keissler菌丝生长适宜温度为25～30 ℃，适宜pH为6～10；分生孢子萌发最适温度为28 ℃，pH为10，且随湿度增加，分生孢子萌发率上升[11]。引起红枣叶斑病的A. tenuissima和A. alternata的菌丝生长适宜温度为25～30 ℃，适宜pH为7～9[12]。毛叶枣黑斑病菌A. alternaria生长和产孢的温度范围为10～35 ℃，适宜温度25～30 ℃；pH 3～11时均能生长和产孢，pH 6～7时最适生长，pH 5时最适产孢；孢子萌发率在25 ℃和pH 7时最高，且在饱和湿度再加水滴的条件下孢子才能很好萌发[13]。目前，国内外尚没有针对赞皇枣黑腐病菌A. tenuissima进行生物学特性研究的报道。本文通过测定不同培养基、碳源和氮源，以及温度、酸碱度、光照对该病菌菌丝生长、产孢量和孢子萌发的影响，以明确其生物学特性，为深入了解赞皇枣黑腐病的多病菌侵染机理和发生规律，并根据不同致病菌的特点开发有效生防制剂，并制定合理有效的防控技术提供依据。

1 材料与方法

1.1 病原菌的分离及鉴定

供试病果于2013年8月采集自山西省石楼县赞皇枣种植基地，按常规组织分离法进行病原菌分离，经菌丝尖端纯化法获得纯培养菌株，按照柯赫氏法则回接证病，该病菌单独侵染可导致枣果发病，说明其是引起赞皇枣黑腐病的病原菌。经形态学和ITS rDNA分子鉴定相结合鉴定该病原菌为 A. tenuissima，常规保存用于生物学特性测定。

1.2 营养条件对菌丝生长和产孢量的影响

孢子悬液制备：将A. tenuissima菌株转接于PDA斜面，28 ℃活化培养5 d后，用无菌水洗脱孢子，调节浓度为30～40个/视野（150×），置4 ℃备用。

菌饼制备：取孢子悬液0.2 mL均匀涂布在PDA平板上，28 ℃恒温培养2 d后，用无菌打孔器制备菌饼（d=7 mm），待用。

菌丝生长测定：接种菌饼于各处理培养基平板中央，28 ℃恒温培养7 d，隔天采用十字交叉法[14]测量菌丝生长速率，并观察记录菌落颜色及长势。菌丝生长速率（mm/d）=（菌落直径-菌饼直径）/t。每个处理均重复3 次。

产孢量测定：测定菌丝生长速率的同时，在第六天采用血球计数板法[14]测定产孢量。方法如下：将在不同处理下生长形成的菌落，分别打取5块菌饼（d=7 mm），放入装有2 mL无菌水的试管中，充分振荡制成菌悬液，用血球计数板在显微镜下直接计数。每处理5次重复，每重复观察10个视野。

1.2.1 培养基 马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）、玉米粉培养基（SCS）、查氏培养基（CZA）、合成真菌培养基（CDA）、燕麦琼脂培养基（OMA）和玉米吐温80琼脂培养基（CMA）。

1.2.2 碳源 以CZA为基础，分别用葡萄糖、蔗糖、甘露醇、柠檬酸三钠和甘油代替葡萄糖为碳源，制备培养基。用量以30 g葡萄糖中的含碳量为标准进行换算[15]，以不加碳源的CZA为对照。

1.2.3 氮源 以CZA为基础，分别用硝酸钠、尿素、硝酸铵、硫酸铵和氯化铵代替硝酸钠为氮源[15]，制备培养基。用量以3 g硝酸钠中的含氮量为标准进行换算，以不加氮源的CZA为对照。

1.3 培养条件对菌丝生长和产孢量的影响

培养方法、重复次数、对菌丝生长和产孢量的测量和计算方法同“1.2”。

1.3.1 温度 设20、24、28、32和36℃ 5个梯度。

1.3.2 初始pH 用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl调节PDA培养基的pH分别至5、6、7、8、9和10。

1.3.3 光照 设24 h全光照（40 W日光燈，2 300 lx）、12 h光照/12 h黑暗交替和24 h全黑暗3种光照条件。

1.4 培养条件对分生孢子萌发的影响

萌发率测定：在不同条件下采用凹玻片悬滴法培养并观察[16]，孢子浓度为20～30个/视野（400×）；以芽管长度超过孢子短半径一半作为萌发标准，在显微镜下检查、记录分生孢子萌发数（检查数>500个），计算萌发率。孢子萌发率 =（孢子萌发数/已查孢子总数）×100%。

1.4.1 时间 分别于3、6、9、12、24和36 h镜检，确定最佳萌发时间。

1.4.2 温度 将孢子悬液分别置于20、24、28、32和36 ℃下培养，在最佳萌发时间镜检并统计萌发率。

1.4.3 初始pH 用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl调节孢子悬液pH为3、4、5、6、7、8、9、10，置最适温度下培养，并在最佳萌发时间镜检和统计。

1.4.4 光照 设置24 h全光照（40 W日光灯，2 300 lx）、12 h光照/12 h黑暗交替和24 h全黑暗3种光照条件，置于最适温度和pH下培养，在最佳萌发时间观察和统计。

1.5 数据分析

运用SPSS 17.0软件对数据进行差异显著性分析，用Origin8.0软件进行图表绘制。

2 结果与分析

2.1 营养条件对A. tenuissima菌丝生长和产孢量的影响

2.1.1 培养基 在不同培养基上，A. tenuissima的菌丝生长速率大小依次为：PDA>SCS>CZA>CDA>OMA>CMA（表1），其中在PDA、SCS和CZA培养基上菌丝生长最快，三者间无显著差异；但菌丝致密度、菌落形态、颜色等在不同培养基上有一定差别（表1）。PDA培养基上产孢量显著高于其他处理，与其余5种培养基上的产孢量相比差异显著。

2.1.2 碳源 A. tenuissima能利用多种碳源（表2），以葡萄糖和甘油为碳源时，气生菌丝旺盛，生长速度显著高于其他处理。在以对照的碳源、蔗糖、甘露醇为碳源时，生长速率差异不显著。碳源为柠檬酸钠时生长最为缓慢，且菌落形态不规则。A. tenuissima在无碳培养基中产孢量最多，与其他碳源差异极显著；柠檬酸钠作碳源时不产孢。

2.1.3 氮源 不同氮源对菌丝生长的影响差异明显（表2）。硝酸钠和尿素为氮源时A. tenuissima的生长情况最好，且产孢量最大，与其他处理相比差异显著。不添加氮源的对照培养基中也有孢子生成，产量仅次于硝酸钠处理。硝酸铵、尿素和硫酸铵作氮源时不产孢。

2.2 培养条件对A. tenuissima菌丝生长和产孢量的影响

2.2.1 温度 A. tenuissima在24～32 ℃之间，菌丝生长速率快，长势良好；20 ℃时菌丝生长速度缓慢，气生菌丝纤细稀疏；36 ℃时菌丝生长受到明显抑制。该菌在20～32 ℃下均能产孢，最适产孢温度为24～28 ℃，36 ℃时未见孢子产生（图1）。

2.2.2 pH 初始pH为5～10的范围内A. tenuissima均能生长，但在pH 6～10时，生长速度快且菌落致密，处理间差异不显著。pH 8～10时产孢量较大，pH 10时出现显著的产孢高峰，pH≤7时不产孢（图1）。

2.2.3 光照 光照条件对A. tenuissima的生长影响不显著；但对产孢量的影响较大，全黑暗条件下产孢量最大，且显著高于全光照和光暗交替处理（图1）。试验中还发现在光暗交替条件下，A. tenuissima的菌落在生长过程中有同心轮纹出现。

2.3 培养条件对A. tenuissima分生孢子萌发的影响

2.3.1 时间 A. tenuissima的孢子萌发率随处理时间的延长而提高，在24 h时为77%，36 h時达到81%，但二者之间差异不显著。因此可认为24 h是孢子萌发的最佳时间（图2）。

2.3.2 温度 温度对A. tenuissima的孢子萌发具有一定影响，20～36 ℃范围内均能萌发，但28 ℃时萌发率最高，为77%，此后随温度的升高或降低萌发率均呈现下降趋势（图2）。

2.3.3 pH 酸碱度对A. tenuissima的孢子萌发影响较大（图2）。pH 6～7时萌发情况最佳，且以pH 6时平均萌发率最高（76%），但二者间差异性不显著；pH≤5或≥8时孢子萌发率急剧下降。

2.3.4 光照 不同光照条件对A. tenuissima孢子萌发也有一定影响，黑暗处理更利于孢子萌发，且萌发率显著高于其他处理（图2）。

3 讨论

链格孢属真菌由于兼有寄生和腐生性，适应环境能力强，可在田间、运输及贮存过程中引发霉变，其生物学特性因宿主所处地理、气候及生态环境不同存在差异。病原物生物学特性的研究，对于研究和掌握病害的发生、流行等具有重要意义。

对赞皇枣黑腐病菌（A. tenuissima）生物学特性的研究表明，该菌在不同培养基条件下均可生长和产孢，但生长速度和产孢量存在差异，说明该菌株对生长条件要求不苛刻。碳源和氮源的种类对菌丝生长和孢子产生有较大的影响。葡萄糖为碳源时，菌丝生长最为旺盛；碳胁迫利于促进孢子产生，这与王义勋等[17]的研究结果基本一致，但与郑晓莲等[18]研究的结果不同。硝态氮为氮源时，菌丝生长状况最好，但氯化铵对菌丝生长有抑制作用，该结果与席兴文等[19]、范文忠等[20]的报道相似，这可能与菌株遗传特性及氮源不同形式的利用率有关。无碳或无氮条件下，从生长速率看该菌均能正常生长；从菌落形态看，则菌丝生长稀疏，不茂盛。这一现象在其他Alternaria属真菌上也有类似情况发生[13-20]，但对病菌的致病力是否有影响，还有待研究。

山西省石楼县产枣区属于梁峁沟壑区，受地势地形影响温度高、温差大[21]，每年7～9月上旬为赞皇枣黑腐病的发病高峰期，此时日最高温度可达28～30 ℃。黑腐病菌（A. tenuissima）的适生温度范围较广，菌丝生长、产孢及孢子萌发的最适温度均为28 ℃，属于中温型病原菌，这正好与当地田间的实际发病规律相符合。

A. tenuissima的菌丝在pH 6～10时生长速度均较快，pH≥7时产孢量逐渐增加，pH 10时产孢量达高峰，但孢子萌发率在pH 6～7时最高。上述结果说明，该菌对酸碱度有很强的适应能力，偏碱性环境更利于A. tenuissima进行生殖生长，产生分生孢子，但中性条件更利于孢子萌发进行营养生长，该结果与王志霞等[12]的研究基本一致。王宏等[16]报道，病原菌在生长进程中，能分泌产生某些物质，从而改变培养液的pH，使其更利于菌丝生长。Prusky等[22，23]报道，病原菌能调节寄主植物的pH值作为增加毒力的一个机制，引起柿子黑斑病的A. alternata （Fries） Keiseler，也能改变柿子的pH，且在培养基上培养时，发现培养基中氨含量增加，pH升高。本研究中孢子萌发和产生的最佳pH不同的原因是否在此，还待后续进行研究。

光照对A. tenuissima的菌丝生长速率影响不明显，在任何条件下都能正常生长，但A. tenuissima的菌落在光暗交替条件下有同心轮纹出现。郑晓莲等[18]也报道，光暗交替可导致A. tenuis的菌落出现同心轮纹状，轮纹宽度随光暗间隔的时间而有差异，这一现象可能预示着光照对A. tenuissima生长还存在着一些未知的影响。孢子的产生和萌发对光照条件比较敏感，黑暗条件下产孢量最大、萌发率最高，可见黑暗条件可促进该菌分生孢子的产生和萌发。由此可知，光照虽并非制约病菌侵染的决定性因素，但在连续阴天、光照强度降低时，更利于病害的流行，同时也暗示了带菌枣果在贮藏环境下引发黑腐病的情况可能更严重。

综上可知，A. tenuissima对营养利用和环境条件的适应能力均较强，这给赞皇枣黑腐病的防治带来了一定的困难。因此，针对该菌的生物学特性和当地的气候条件，采取合理的综合防治措施，对控制该病的发生和蔓延至关重要。

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