朱砂肾脏毒性的分解研究

史 立，孙 友，李 佳，李丹阳，赵跃刚

（长春中医药大学药学院， 长春 130117）

朱砂肾脏毒性的分解研究

史 立，孙 友，李 佳，李丹阳，赵跃刚*

（长春中医药大学药学院， 长春 130117）

目的 研究朱砂中与血液中汞离子浓度以及肾脏毒性相关的成分，为朱砂的减毒炮制以及在临床上的科学用药提供重要的理论依据。方法 应用偏微分原理，运用化学、毒理学、药动学以及细胞学的研究方法，对朱砂中与其毒性相关的成分进行均一背景下的分解研究，从中找出与朱砂肾脏毒性相关的主要成分。结果 整体实验研究表明，朱砂中共存成分改变了汞在血液以及体液中的化学位，从而改变离子通道的通透性，有利于汞离子通过离子通道而被吸收以及在肾脏中分布；朱砂中的肾脏毒性成分并非仅来源于硫化汞或汞本身，其他共存成分对朱砂毒性的影响也是不可忽视。结论 改进朱砂的炮制方法，在朱砂的炮制过程中，尽量除去硝酸根、氯离子、镁离子等不必要的共存离子，减小水飞朱砂的毒性，可提高临床用药的安全性和制剂的安全性。

朱砂；肾脏毒性；汞离子；炮制方法

Abstract: Objective To study some components relative to the concentration of mercury in plasma and the toxicity associated with cinnabar, and provide important evidence for the safety and reasonable application of cinnabar in clinical medicine and scientific preparation.Methods On the basis of partial differential principle, doing research on the components concerned to cinnabar toxicity respectively and equally by the methods of chemistry,toxicology, pharmacokinetics and cytology for finding components corresponding to cinnabar toxicity.Results The overall experimental results show that some coexisting ingredients of cinnabar may cause the changes of the chemical potential of mercury in plasma, as well as body fluid, and the permeability of the ion channel, which is conducive to gastrointestinal absorption and transportation to kidney of mercury ions.Experiments on cells indicate that almost all its components of cinnabar contribute to its toxicity.Conclusion In order to reduce the toxicity of water-handled cinnabar and make it safer, both in clinical treatment and industrial products, cinnabar processing methods should be improved by removing nitrate, chloride, magnesium ions unnecessary coexisting ions .

Keywords: cinnabar; nephrotoxicity; mercury ion; processing method

朱砂以其确切的疗效而使其药用价值位居矿物药之首，然而其被人们逐渐认知的毒性备受科学界乃至全社会的关注[1]。朱砂中含有几十种元素，而且基本都以无机形式存在，每种元素在体内的吸收、分布与排泄过程都涉及微孔途径的被动转运[2]，每种成分都和朱砂的毒性有一定的关系[3-9]。为了探究朱砂肾脏毒性的机理，笔者首先对朱砂的毒性进行了分解研究，并将血液和肾脏同时作为研究对象，采用药物动力学以及病理学方法，对朱砂的肾脏中毒机理进行了初步的分解研究。

1 材料与方法

1.1 材料 AFS-930 原子荧光分光光度计（北京吉天仪器有限公司），SANYO二氧化碳培养箱（日本SANYO公司），SANYO 超低温冰柜（日本SANYO公司），Themo生物安全柜，BIO-RAD酶标仪(美国伯乐公司），Mettler Toledo AL204电子分析天平（万分之一），TD 40台式低速离心机（4 000 r/min）（湖南凯达科学仪器有限公司），YXQ-LS-50立式压力蒸汽灭菌器，可调微量移液器 （上海亚荣生化仪器厂），水飞朱砂（河北凯达药业有限公司），胎牛血清（浙江天杭生物有限公司），DMEM干粉培养基（GIBCO）、胰蛋白酶（北京鼎国昌盛有限责任公司）等。

1.2 方法

1.2.1 给药供试品的制备 将1.0 g水飞朱砂置于冰水浴中，使之在40 kHz频率超声波作用下溶出，于不同时间点取样，用原子荧光分光光度法分析游离金属汞的总含量。依据研究结果和汞在胃肠道的吸收机理以及在体内的表观分布容积，确定朱砂及其他药物动力学研究灌胃给药供试品的制备方法。朱砂、HgS平行定量实验组、HgCl2平行定量实验组供试品的游离汞含量均为8.561 µg/mL；HgCl2高剂量实验组供试品的游离汞含量均为171.22 µg/mL。

1.2.2 标准曲线的测绘 选择优级纯的HgCl2为标准品，用0.1%的K2Cr2O7的10%的HNO3溶液为溶剂，配制HgCl2储备液（1.0 mg/mL）,备用。分别定量移取储备液0.25、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50 mL至10 mL的容量瓶中，各定量加入家兔血浆500 µL，并用作为溶剂的0.1%的K2Cr2O7的 10%的 HNO3溶液定容至刻度，得25、50、100、150、200、250 ng/mL的标准溶液，与原子荧光光度计上测定其吸光度，线性回归，得标准曲线方程Y=3.502 X-0.921(r2=0.998 8)。

1.2.3 血浆供试品制备 按照预先设定的时间点从实验家兔耳缘静脉采血1.0 mL，置入肝素化试管中，精密加入50 µL35%的HClO4,涡旋振荡1 min，于4 000 r/min离心10 min。精密量取上清液300 µL，用0.1%的K2Cr2O7的10%的HNO3溶液定容至10 mL，测定其吸光度。

1.3.4 组织供试品制备 对称取实验家兔耳肾脏区2.0 g，制成组织匀浆，于4 000 r/min离心10 min，取上清液500 µL，精密加入50 µL 35%的HClO4,涡旋振荡1 min，于4 000 r/min离心10 min。精密量取上清液300 µL，用0.1%的K2Cr2O7的10%的HNO3溶液定容至10 mL，测定其吸光度。

2 结果

2.1 单剂量给药动力学研究 分组：将30只家兔随机分为5组，第1组为阴性对照组，第2组为朱砂实验组，第3组为HgS实验组，第4组和第5组为平行量的HgCl2实验组和高剂量的HgCl2实验组。给药：第2组灌胃给2 mL供试品；第3组灌胃给HgS平行定量供试品溶液2 mL；第4组灌胃给HgCl2平行定量供试品溶液2 mL，第5组灌胃给20倍标示量的HgCl2供试品2 mL。于给药后的0.5、1.0、1.5、2.0 h取全血进行分析。结果在灌胃给药后的0.5～2.0 h，除平行量HgCl2实验组外，朱砂实验组、HgS实验组、高剂量HgCl2实验组的Hg2+在血液中的浓度均高于阴性对照组，且随着时间的增加而增大，差异具有统计学意义( P＜0.05)。而平行量HgCl2实验组与阴性对照组比较，差异无统计学意义。

2.2 多剂量给药动力学研究 分组：将30只家兔随机分为5组，第1组为阴性对照组，第2组为朱砂实验组，第3组为HgS实验组，第4组和第5组为平行量的HgCl2实验组和高剂量的HgCl2实验组。给药：第2组灌胃给2 mL供试品；第3组灌胃给HgS平行定量供试品溶液2 mL；第4组灌胃给HgCl2平行定量供试品溶液2 mL，第5组灌胃给20倍标示量的HgCl2供试品2 mL。均灌胃给药1次/d，并于给药后1.0 h取全血进行分析。结果在灌胃给药后的10、20、40 d，朱砂实验组、HgS实验组、平行量HgCl2实验组、高剂量HgCl2实验组的Hg2+在血液中的浓度均高于阴性对照组，且随着时间的增加而增大，其差异具有统计学意义( P＜0.05)。

2.3 MTT细胞增值实验研究 本次实验共设置5组，第1组为空白对照组：以正常增值细胞为空白对照组；第2组为朱砂实验组：以朱砂静止饱和溶液为供试品(Hg2+浓度为3.2 μg/mL )；第3组为静止饱和溶液实验组：HgS静止饱和溶液为供试品（Hg2+浓度为5.3 μg/mL ）；第4组为高剂量氯化汞实验组（Hg2+浓度为10.0 μg/mL ），第5组为中剂量氯化汞实验组（Hg2+浓度为5.0 μg/mL ），第6组为中剂量氯化汞实验组（Hg2+浓度为2.0 μg/mL ）。取同批次对数生长期HEK 293细胞，用含10%胎牛血清的培养液配成单个细胞悬液，以每孔10 000个细胞接种到96孔板，每孔体积200 μL。置于5% CO2，37 ℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板），加入浓度梯度的药物,每种药物设有4个复孔，用以保证药物反应的真实情况，置于5% CO2，37 ℃孵育24 h。取出，每孔加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL，即0.5% MTT），继续培养4 h。取出，终止培养，小心吸去孔内培养液，并于每孔加入150 μL二甲基亚砜，低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶标仪OD 490 nm处测量各孔的吸光值。

结果表明，朱砂实验组、HgS实验组、氯化汞实验组（高、中、低3个剂量实验组）吸光度值均低于阴性对照组，且随着Hg离子浓度的增大其吸光度减小，其差异具有统计学意义( P＜0.05)。

3 小结

本实验结果得出，朱砂中可以让细胞凋亡的并非是目前公认的硫化汞或汞离子，朱砂在体内的蓄积，并以此导致的肾脏中毒问题，亦并非是硫化汞或汞离子，其中共存成分的影响是不可忽视的。本研究结果为朱砂在临床上的安全用药提供了重要的依据。建议改进朱砂的炮制方法，在朱砂的炮制过程中，尽量除去硝酸根、氯离子、镁离子等不必要的共存离子，以提高临床用药的安全性和制剂的安全性。

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Study on the renal toxicity of some components in cinnabar by respective researches

SHI Li, SUN You, LI Jia, LI Danyang, ZHAO Yuegang*
(School of Pharmaceutical Sciences, Changchun University of Chinese Medicine, Changchun 130117, China)

R285.6

A

2095-6258(2017)05-0712-02

2017-03-01）

OI：10.13463/j.cnki.cczyy.2017.05.008

吉林省中医药管理局中医药科技项目“朱砂中与其肾脏蓄积相关成分的量效关系研究”（2014-Q27）。

史 立（1959 -），男，实验师，主要从事药物分析及药物化学研究。

*通信作者：赵跃刚，电话-13604414377，电子信箱-1006110724@qq.com