GPC净化高效液相色谱法测定辣椒粉中苏丹红

倪炜华，鲍晓瑾，翁光灿，周燕

（嘉兴市食品药品检验检测院，浙江嘉兴 314000）

GPC净化高效液相色谱法测定辣椒粉中苏丹红

倪炜华，鲍晓瑾，翁光灿，周燕

（嘉兴市食品药品检验检测院，浙江嘉兴 314000）

文章中建立了通过GPC净化处理，应用高效液相色谱法检测辣椒粉中苏丹红的实验方法。样品经乙酸乙酯/环己烷（1∶1）提取，通过GPC分离净化，浓缩后用乙腈定容，以0.1%甲酸的水溶液和乙腈（85∶15）以及0.1%甲酸的乙腈溶液和丙酮（80∶20）作为流动相进行梯度洗脱，经高效液相色谱分离，紫外检测器测定，外标法定量。该方法在0.05～5.0mg/L范围内呈良好的线性关系，平均回收率为88.1%～98.1%，相对标准偏差为0.90%～4.02%，检出限为0.0054～0.0088mg/kg。该方法精密度好，灵敏度高，能简便、快速、准确地测定辣椒粉中的苏丹红（Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ）残留量。

GPC；高效液相色谱法；辣椒粉；苏丹红

苏丹红属偶氮系列染料，是应用广泛的化工合成染色剂，主要应用于蜡、油彩、汽油等工业领域，目前已确认了有机偶氮染料的毒性，其大多数有致癌性［1］，包括苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ和苏丹红Ⅳ。它的化学成分中含有一种叫萘的化合物，该物质具有偶氮结构，由于这种化学结构的性质决定了它具有致癌性，对人体的肝肾器官具有明显的毒性作用，在食品中禁止使用［2］。现有测定苏丹红的方法有很多，主要包括HPLC［3］、UPLC－MS［4，5］、酶联免疫［6］以及流动注射化学发光法［7］等，但最常用的是高效液相色谱法（HPLC）。中国和欧盟［8］均颁布了HPLC测定食品中苏丹红的标准方法。国标GB/T 19681－2005使用正己烷萃取，碱性氧化铝净化［9］，步骤繁琐，且氧化铝难以准确控制活化程度的缺陷，造成方法重现性较差。本文采用GPC净化，高效液相色谱-紫外检测器进行色谱分析，外标法定量，测定辣椒粉中违禁使用的苏丹红，取得了满意的效果，方法回收率范围在88.1%～98.1%。同时，该方法操作简单，能有效去除杂质干扰，满足一般检验机构的检测需求。

1 实验部分

1.1 主要仪器与设备

Agilent 1200高效液相色谱仪 美国Agilent公司；全自动固相萃取定量浓缩仪 德国LC Tech公司；电子天平；离心机 上海安亭科学仪器厂；氮吹仪美国Orgnomation公司；恒温水浴振荡器。

1.2 试剂与材料

苏丹红Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ均购自Dr.Ehrenstorfer公司，分别用乙腈配成100mg/L的储备液，4℃保存，使用时根据需要配成不同浓度的标准工作液；乙酸乙酯、环己烷、乙腈、丙酮、甲酸均为HPLC级；水为超纯水。

1.3 实验条件

色谱柱：色谱柱为Agilent公司的SB C18（150mm× 4.6mm，5μm）；柱温：30℃；进样体积：20μL；流动相A：0.1%甲酸的水溶液和乙腈（85∶15），B：0.1%甲酸的乙腈溶液和丙酮（80∶20）；流动相梯度洗脱条件见表1。

表1 高效液相色谱分离梯度条件

检测波长：苏丹红Ⅰ，478nm；苏丹红Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，520nm。

1.4 样品处理

1.4.1 提取

准确称取2g匀质样品（准确到0.0001g）于离心管中，加入10mL乙酸乙酯/环己烷（1∶1），漩涡混合，超声提取30min。8000r/min下离心10min，将上清液全部转移至GPC进样瓶中。

1.4.2 净化浓缩

GPC吸取5mL样液进行净化，流速5mL/min，弃去前面1500s的淋洗液，收集接下来的600s淋洗液，最后用240s淋洗GPC柱，将收集液转移至旋转蒸发瓶中，45℃旋转蒸发至干。用1.00mL乙腈溶解残渣，过0.22μm有机滤膜，供HPLC测定。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

实验选择0.1%甲酸的水溶液和乙腈（85∶15）以及0.1%甲酸的乙腈溶液和丙酮（80∶20）作为流动相进行梯度洗脱，苏丹红Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ的保留时间适宜，峰形良好，且基线稳定。为了使苏丹红Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ的灵敏度足够高，通过对苏丹红Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ标准溶液进行光谱扫描，最终确定苏丹红Ⅰ的检测波长为478nm，在苏丹红Ⅰ出峰之后，切换波长至520nm，使苏丹红Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ在520nm下出峰。

2.2 提取条件的确定

实验选用乙酸乙酯/环己烷（1∶1）、乙腈、乙醇3种溶剂作提取剂，比较了3种溶剂的提取效率，经过超声提取，结果表明：提取效率相差不大，样品中的苏丹红提取效率均可达90%以上。考虑到过GPC用到的溶剂为乙酸乙酯/环己烷（1∶1），如果用乙腈或乙醇提取，还要进行溶剂替换，增加了实验步骤，易造成损失。所以，本实验最后采用乙酸乙酯/环己烷（1∶1）作为提取剂。

2.3 GPC条件的选择

将苏丹红Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ混合标准溶液经GPC柱，进样量为5mL，流动相为环己烷/乙酸乙酯（1∶1），苏丹红Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ的紫外扫描图见图1。

图1 苏丹红Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ色谱图

由图1可知，苏丹红Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ的流出时间主要集中在25.5～34min，并采用分段收集，上液相检测各阶段苏丹红含量，最终选择收集时间为25～35min，其余时间为丢弃时间。

图2 未过GPC样品图

图3 过GPC后样品图

由图2和图3可知，GPC净化能够有效去除辣椒粉中大量的脂肪及其他脂溶类物质。样品经过GPC净化后，可以有效去除样品中杂质，特别是苏丹红Ⅲ，保留时间附近经常会出现杂峰，容易发生误判。GPC净化后，可以有效去除这一问题，增加实验结果的可靠性。

2.4 标准曲线、线性范围及检出限

配制苏丹红Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ的混合标准储备液100.0mg/L，并逐级稀释成浓度分别为0.05，0.1，0.5，1.0，5.0mg/L系列的标准工作液，进样量为10μL。以所得峰面积对标准溶液浓度进行回归分析，线性关系良好。线性回归方程式、线性相关系数和检出限（S/N＝3）见表2。

表2 标准曲线及检出限

2.5 回收率和精密度实验

以阴性辣椒粉样品为基体，添加苏丹红Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ的混合标准溶液，按上述方法及仪器条件进行回收率实验，每个添加水平做6次平行，添加水平、平均回收率及精密度见表3。

表3 回收率及精密度实验结果

续 表

由表3可知，辣椒粉中苏丹红Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ含量检测，添加水平在0.02，0.1，0.5mg/kg时，平均回收率为88.1%～98.1%，相对标准偏差为0.90%～4.02%，符合相关规定要求。

3 结论

本文建立了运用GPC凝胶净化，高效液相色谱法检测辣椒粉中苏丹红的方法。该方法前处理步骤少，提取效率高，定量限低，精密度和准确度高，特别是可以有效去除杂质干扰，增加结果的可靠性。

［1］Stiborova M，Martinek V，Rydlova H，et al.Sudan I is a potential carcinogen for humans evidence for its metabolic activation and detoxication by human recombinant cytochrome P450 1A1and liver microsomes［J］.Cancer Res.，2002，62（20）：5678-5684.

［2］贾涛.应用液相色谱分析技术测定饲料中苏丹红含量的探讨［J］.检测技术，2013（4）：53-58.

［3］周建科，刘瑞英，李晓阳.山楂饴中苏丹红的高效液相色谱法测定［J］.现代食品科技，2009，25（2）：208-210.

［4］孙姝琦，田毅敏，杜振霞.超高效液相色谱串联四极杆质谱联用分析番茄酱中苏丹红i～iv含量［J］.分析测试学报，2007，26：225-227.

［5］Hou X，Li Y，Cao S，et al.Analysis of para red and Sudan dyes in egg yolk by UPLC-MS-MS［J］.Chromatographia，2010，71（1）：135-138.

［6］Hu X，Fan Y，Zhang Y，et al.Molecularly imprinted polymer coated solid-phase microextraction fiber prepared by surface reversible addition-fragmentation chain transfer polymerization for monitoring of Sudan dyes in chilli tomato sauce and chilli pepper samples［J］.Anal.Chim.Acta.，2012，731：40-48.

［7］牛丽川，宋正华.流动注射化学发光法测定苏丹红Ⅰ［J］.分析化学，2009，37（A01）：209.

［8］Vérétout O，Demesse L，Szymanski L.Analysis and dosage of the colorants Sudan and Bixin in chili powder and pepper-based products［R］.Health ＆Consumer Protection Directorate-General，European Commission，News Notification：03/99.

［9］GB/T 19681－2005，食品中苏丹红染料的检测方法高效液相色谱法［S］.

Determination of Sudan Red in Chili Powder after Purification with GPC by HPLC

NI Wei-hua，BAO Xiao-jin，WENG Guang-can，ZHOU Yan
（Jiaxing Institute for Food and Drug Control，Jiaxing 314000，China）

Establish a method to detect Sudan red in chili powder after purification with GPC by HPLC.The samples are extracted with ethyl acetate and cyclohexane（1∶1），separated and purified by GPC，after being concentrated to a definite volume with acetonitrile，with 0.1%formic acid water solution and acetonitrile（85∶15）and 0.1%formic acid in acetonitrile solution and acetone（80∶20）as mobile phase for gradient elution，with high performance liquid chromatography for separating，UV detector for determination and external standard method for quantitative analysis.The calibration curves show good linearity in the mass concentration range of 0.05～5.0mg/L，the average recoveries are from 88.1%to 98.1%and the relative standard deviations are from 0.90%to 4.02%，the limits of detection are 0.0054～0.0088mg/kg.This method is simple，rapid，sensitive and accurate for the determination of Sudan red（I，II，III，IV）residues in chili powder.

GPC；HPLC；chili powder；Sudan red

TS201.2

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.03.031

1000-9973（2017）03-0130-03

2016－09－14

倪炜华（1982－），男，浙江嘉兴人，工程师，主要从事食品添加剂检测方面的研究。