生物治疗在下肢缺血性疾病中的应用

龙 刚 综述,黄 文 审校

(重庆医科大学附属第一医院血管外科 400016)

生物治疗在下肢缺血性疾病中的应用

龙 刚 综述,黄 文△审校

(重庆医科大学附属第一医院血管外科 400016)

下肢缺血性疾病；生物治疗；细胞治疗；生长因子

下肢缺血性疾病是可以导致患者截肢甚至死亡的严重疾病，主要包括下肢动脉硬化性闭塞症、血栓闭塞性脉管炎(Buerger′s病)、糖尿病肢体动脉闭塞症等，大多是继发于动脉粥样硬化、动静脉栓塞或血栓形成、糖尿病等，具有发病率、致残率和致死率高等特点[1]。其病因可能与饮食的摄入、吸烟、血液的高凝状态、血糖异常波动等相关，而发病机制目前尚未明确，可能与非特异性炎症介质介导的血管炎症有关[2]。目前的主要治疗手段有扩血管药物治疗、手术和微创介入重建血管等[3]。但上述传统治疗手段对严重血管病变尤其是无流出道的膝下病变治疗效果欠佳，以“血管新生”为基础的生物治疗为下肢缺血性疾病的临床研究提供了新的方向[4]。目前对于下肢缺血性疾病的生物治疗大致分为细胞治疗和生长因子治疗。

1 细胞治疗

1.1脐血干细胞治疗 脐血干细胞是一类以分化潜能为特点的祖细胞，具有形成集落、增殖、分化的能力，由于脐血免疫原性较弱，使其不易被免疫排斥、能够在体内长期存活。脐血干细胞可诱导分化成内皮祖细胞并分泌多种细胞因子对缺血肢体内的新生血管形成有促进作用，可改善肢体血流。对患有Buerger′s病的下肢进行脐血干细胞移植治疗，效果显示疼痛症状明显缓解，皮肤溃疡愈合，远端血管造影显示大量毛细血管形成[5]。有人将脐血干细胞应用于有缺血、溃疡的模型，证实来源于脐血的内皮前体细胞参与新生血管形成[6]。有研究将人脐血干细胞注射在下肢缺血患者肌肉的多个部位，发现其可改善冰凉、疼痛等症状[7]。但脐血干细胞移植技术仍存在一些问题：(1)无统一的标准以便于提取更高纯度内皮祖细胞；(2)其相应纳入标准及剂量和疗程需量化及规范；(3)其祖细胞向目的细胞的转化、增殖与分化机制尚不明确，且增殖的程度和速度无法控制[8]。

1.2外周血干细胞治疗 外周血干细胞是指游离在循环血中的干细胞，其不但能多向分化还能不断更新。存在于其中的祖细胞被定向诱导后可以分化为内皮细胞[9]。将其注射于缺血组织后，内皮祖细胞局部的高浓度有利于其存活，而低氧的组织环境有助于提高内皮祖细胞的增殖分化能力促进血管新生效应[10]。有学者将外周血干细胞移植于有下肢缺血性溃疡形成的肢体中，观察疗效显示大部分患肢症状好转[11]。黄平平等[12]把该细胞移植技术应用于下肢动脉硬化闭塞症患者，结果患肢相应缺血症状好转，踝肱指数上升且影像学提示有新生血管形成。有研究使用此法治疗缺血性下肢血管病明确了该移植技术可明显改善缺血患肢的微循环情况[13]。但外周血干细胞移植具体机制尚未明确，未分化干细胞可能在该部位非定向分化或过量堆积而形成瘤样组织，远期是否存在致瘤性、致突变等不良反应，其对应的存活、增殖转化情况及移植后效果评价有待解决[14]。

1.3骨髓间充质干细胞治疗 骨髓间充质干细胞也具有一定多向分化的能力。2002年Tateishi-Yuyama等[15]于临床上使用此干细胞针对下肢缺血性疾病的移植治疗，并取得成功。国内有专家应用此移植技术治疗糖尿病足，结果发现缺血下肢有新生侧支血管形成，患肢的缺血症状缓解[16]。国外有研究表明，骨髓干细胞通过改善组织灌注在治疗重症下肢缺血症中具有良好的效果[17]。其作用机制可能为在组织缺损及相对缺血缺氧条件下可启动特异性基因表达，分泌细胞因子及相关蛋白，使间充质干细胞不断分化[18]。骨髓间充质干细胞移植目前同样存在缺乏客观的指标及有效的疗效评价体系等问题[19]。

2 生长因子治疗

2.1血管内皮细胞生长因子(VEGF)治疗 VEGF能作用于血管内皮细胞诱导血管生成，在血管发生和血管形成过程中起重要作用，多种促血管生长因子如血小板源性生长因子、间质细胞源性因子、肿瘤坏死因子等通过增强VEGF的表达起作用[20]。根据作用方式的不同可分为VEGF蛋白治疗与VEGF基因治疗。VEGF蛋白治疗是利用 VEGF蛋白制剂根据治疗需要反复多次给药，不但价格昂贵而且需反复多次操作，但随着基因技术的不断发展和探索，使用载体维持 VEGF有效浓度促进血管新生得以应用。Sun等[21]采用特殊的方法将 VEGF混入特制的可降解复合材料中置于下肢缺血模型中,最终缓释的VEGF血管生成作用得到肯定。VEGF基因治疗则是将含有VEGF的活性基因片段导入目的细胞中进行治疗。Tsurumi等[22]直接将VEGF基因导入动物下肢缺血模型中，发现大量的新生血管形成且局部组织存在目的基因及相关蛋白表达。VEGF有很强的诱导新生血管形成的作用，但临床应用中存在量效和时效的局限性[23]；它不但能增加血管通透性导致组织水肿，还可能引发或加重肿瘤、增殖性视网膜病变等[24]。

2.2成纤维细胞生长因子(FGF)治疗 FGF主要以碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和酸性成纤维细胞生长因子(eFGF)为主，而bFGF的作用大于eFGF。bFGF对不同来源的细胞其促进增殖及分化效果不同，其中中胚层细胞效率最高。能够有效地诱导核细胞分化为目的细胞，从而促进新生血管形成[25]。bFGF可促进缺血组织的血管再生，Baffour等[26]发现在缺血组织注入bFGF后，缺血组织活力明显改善，新生的毛细血管数量也显著增加，不但增加了缺血组织的血液灌注量，而且也加快了组织微血管再生。但bFGF可以诱导内皮细胞新生，还能诱发其他血管细胞的病理性增殖从而导致进一步狭窄、肿瘤形成，同时可引起血压下降、血红蛋白降低、肾脏疾病等[27]。

2.3肝细胞生长因子(HGF)治疗 HGF又称离散因子(scatter factor),属纤溶酶原相关性生长因子(PRGF)家族中的一种可溶性细胞因子,由间质细胞合成分泌,通过不同分泌方式对组织及细胞起作用。HGF是间质和上皮/内皮细胞间相互作用的重要信息分子，对胚胎发育、组织器官再生、伤口愈合和血管发生起重要的调节作用[28]。HGF促进血管生成是通过促进血管内皮细胞迁移和刺激血管平滑肌细胞而起作用,因其不刺激平滑肌细胞增殖故可防止内膜所致管腔狭窄[29]。HGF受体是由A、B亚基组成的异二聚体蛋白，它与受体c-Met结合后通过激活如Ras/RAF、PI3K/AKT/mTOR、JAK/STAT、Crk/C3G/Rap1等促进血管生成，还可以通过上调VEGF、FGF、NO等间接地参与血管的生成[30]。但是HGF仍然存在在体内持续时间短、有效浓度不稳定等劣势，限制了其进一步的发展。基因转染可有效解决这一劣势，其载体主要包括病毒与非病毒载体，病毒载体通过整合靶基因或与宿主基因融合表达目的基因，但存在安全性、转导成功率低等问题[31]。非病毒载体中脂质体因带电荷与相应物质发生反应后半衰期缩短[32]，且与靶细胞结合后易引起免疫反应或被降解[33]，多聚物载体潜在毒性和效率问题,目前仍在研究中。质粒DNA载体删除与人基因组可能同源的序列，以及在哺乳动物细胞中表达所不需要的序列，不与宿主基因整合，随着宿主染色体复制而复制[34]，随细胞分裂而分离到子代细胞中，其携带的目的基因可持续表达，故而质粒载体具有安全性好、体内维持时间长的优点[35]。含HGF基因的重组质粒pUDK-HGF能够有效转移于完全缺血和部分缺血的肢体肌肉组织，重组质粒转染横纹肌细胞后，可利用横纹肌细胞的蛋白合成系统，合成和分泌具有促进血管生长作用的HGF蛋白分子，诱导阻塞的动脉外膜表面的毛细血管萌芽出新血管，逐渐扩大连接到远端动脉[36-37]，从而形成新生血管并建立侧支循环。有研究使用含有人HGF基因的载体注射于下肢缺血的动物模型中,结果显示在缺血区域存在目的蛋白且该区域有大量血管新生[38]，证实载体与目的蛋白存在量效关系。与VEGF、FGF相比，HGF不但具有抗炎抗氧化、促进血管新生，而且能够抑制炎症、水肿和细胞衰老。pUDK-HGF有抗纤维化作用，能减少组织再生障碍，而VEGF和FGF能诱导组织纤维化，加重组织再生障碍。pUDK-HGF刺激产生的新生血管成熟较早，避免了向基质中释放血细胞起源的其他细胞，HGF在其促进血管生成活性方面比VEGF及bFGF更强且更安全[39-40]。目前关于pUDK-HGF注射液的Ⅰ期临床研究结果表明pUDK-HGF对肢体缺血组织血管生成有促进作用[41]。pUDK-HGF注射液的Ⅱ期临床研究已基本结束，结果显示对于肢体缺血性疾病有治疗作用。所以，pUDK-HGF在治疗下肢缺血性疾病上不但减少细胞治疗带来的增殖、分化、突变、致瘤等风险，而且较单纯的生长因子治疗更有优越性。

下肢缺血性疾病治疗正从传统的药物、手术治疗逐渐转变到生物基因治疗。在生物治疗中干细胞有多向分化的能力并对血管形成有促进作用[42]，但其增殖与分化机制、移植后的疗效及肿瘤效应还需进一步探索。生长因子能够诱导血管生成，也可能引发增殖性疾病、加重血管狭窄且可能合并半衰期短及有效浓度不稳定等问题存在。通过基因转染技术及质粒载体技术解决了生长因子半衰期及有效浓度维持的问题，可促进其应用。干细胞移植治疗及生长因子注射治疗有单独或联合应用于临床的潜力[43]，可能成为有效治疗下肢缺血性疾病的新途径。

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龙刚(1989-)，住院医师，硕士，主要从事生长因子下肢缺血性疾病移植治疗。△

,E-mail:382269637@qq.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.34.040

R543

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1671-8348(2017)34-4865-03

2017-08-18

2017-09-25)