天山雪莲细胞液体悬浮培养基的优化研究

孙国政，马江,2，曹磊,2，陆攀科,2，罗俏俏,2，张忠明,2

1.甘肃陇域商贸有限公司，兰州，730030；2.甘肃农业大学食品科学与工程学院，兰州，73000

天山雪莲系菊科多年生草本植物，由于出色的抗炎、抗肿瘤及抗疲劳活性，几个世纪以来天山雪莲一直是传统的名贵中药材[1-2]。分布于高山雪线附近，生存环境恶劣。在自然条件下，雪莲种子萌发及幼苗成活率低于5%[3]。雪莲组织培养主要采用其茎尖或叶片进行繁育，然而雪莲对生长环境要求高，对运输和保存过程中的温度和湿度控制不易把握，获得茎尖和叶片等器官在时间和地域上都具有一定的局限性[4]。

植物细胞的悬浮培养是指将植物细胞或较小的细胞团悬浮在液体培养基中进行培养，在培养过程中能够保持良好的分散状态[5]。与固体培养相比，液体悬浮培养有良好的混合、流动性能及更高的传质效率。目前这项技术已经广泛应用于细胞的形态、生理、遗传、凋亡等研究工作，特别是为基因工程在植物细胞水平上的操作提供了理想的材料和途径。在雪莲细胞液体悬浮培养中，培养条件对细胞的增殖具有关键作用[6]。

本试验优化了雪莲细胞液体悬浮培养基，以期为雪莲细胞的大规模液体悬浮培养奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

从天山雪莲外植体诱导得到的愈伤组织，经过反复筛选得到了现在的高产细胞系。

液体悬浮培养培养基：MS培养基，不加琼脂，pH 5.8。

MS母液、6-BA溶液、NAA溶液、蔗糖、琼脂、NaOH、95%乙醇、升汞、赤霉素GA3。

1.2 仪器与设备

HWS26型电热恒温水浴锅，上海一恒科技有限公司；AL204电子天平，梅特勒–托利多仪器上海有限公司；GZX-GF101-Ⅱ电热恒温鼓风干燥箱，上海跃进医疗器械有限公司；NRY-200恒温摇床，上海南荣实验室设备有限公司；TGL-20M高速台式冷冻离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司；SW-CJ-ZFD型双人单面净化工作台，苏州净化设备有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 细胞液体培养

采用接种量为2.5g/L，培养基装量为250mL三角瓶装有50mL培养基，实验中摇床转速为110～120转/分钟，培养温度为25℃，光照时间16h/d。取液体培养13天的细胞培养液离心后，用蒸馏水冲洗三次，置于60℃烘箱中烘干24h，测定细胞干重和黄酮含量。

1.3.2 氮源对雪莲细胞生长及黄酮含量的影响

调节 MS 培养基中的总氮（NH4NO3和 KNO3）浓度分别为 25、30、35、40、45、50、55 mmol/L，培养后测定雪莲细胞干重和黄酮含量，考察氮源对雪莲细胞生长和黄酮合成的影响。

1.3.3 碳源对雪莲细胞生长及黄酮含量的影响

分别采用葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖和可溶性淀粉作为碳源，质量浓度均为30 g/L，培养后测定雪莲细胞干重和黄酮含量，考察不同种类碳源对雪莲细胞生长和黄酮合成的影响。

1.3.4 蔗糖浓度对雪莲细胞生长及黄酮含量的影响

采用蔗糖作碳源，使质量浓度分别为 25、30、35、40、45、50、55 g/L，培养后测定雪莲细胞干重和黄酮含量，考察蔗糖浓度对雪莲细胞生长和黄酮合成的影响。

1.3.5 培养基 pH值对雪莲细胞生长及黄酮含量的影响

调节培养基 pH值，使其分别为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，培养后测定雪莲细胞干重和黄酮含量，考察不同培养基pH对雪莲细胞生长和黄酮合成的影响。

1.3.6 正交试验

在单因素试验的基础上，选择总氮浓度、蔗糖浓度和pH 3个影响因素进行正交试验，以进一步优化培养基的成分，提高雪莲细胞中黄酮的含量。

1.3.7 标准曲线的制作

准确称取0.1g芦丁，置500 mL烧杯中，加入乙醇溶解，制得质量浓度为0.2 g/L的芦丁对照品溶液。准确量取芦丁对照品溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL分别置于10 mL量瓶中，分别加乙醇溶液至3.0 mL，加5%亚硝酸钠溶液0.3 mL，摇匀，放置6min，加10% A1(NO)3溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min，最后加1 mol/L NaOH 溶液4 mL，再加去离子水稀释至刻度线，摇匀，放置15 min，在 510 nm 波长处测定吸收度，以吸收度为纵坐标，对照品浓度为横坐标，绘制标准曲线。

1.3.8 黄酮含量的测定

将干燥的天山雪莲培养物分别用粉碎机粉碎，过80目筛。各称取0.50g干燥粉末，置于锥形瓶中，加入乙醇至60mL，称重。超声萃取90 min，取出，补足重量，过滤，收集滤液，乙醇补充损失体积，所得溶液即为供试品溶液，实验重复三次。取供试品溶液各1 mL分别置于10 mL量瓶中，加乙醇溶液至3.0 mL，加5%亚硝酸钠溶液 0.3 mL，摇匀，放置6 min，加10% Al(NO) 3溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min，最后加1 mol/L NaOH 溶液4 mL，再加去离子水定容至10 mL，摇匀，放置15 min，在510nm 波长处测定其吸收度，计算黄酮的含量[7]。

2 结果与分析

2.1 氮源对雪莲细胞生长及黄酮含量的影响

表1 氮源对雪莲细胞生长及黄酮含量的影响

氮是一种重要的大量元素，其与植物生长和基因表达的信号传导有关，硝态氮（NO3-）可提高氨基酸和蛋白质量，改变激素量，同时调节碳代谢，从而影响总黄酮的生物合成[8]。由表1可以看出，随着总氮浓度的升高，细胞干重先升高后降低，在35 mmol/L时，细胞干重达到最大，而后逐渐下降；细胞中的黄酮含量的变化趋势与细胞干重的变化类似，在总氮浓度为35 mmol/L时，黄酮含量达到最大（65.5 mg/g），而后逐渐下降，当总氮浓度升高到55mmol/L时，黄酮含量为58.8 mg/g。综合考虑，应该选择总氮浓度在35～45mmol/L。

2.2 碳源对雪莲细胞生长及黄酮含量的影响

表2 碳源对雪莲细胞生长及黄酮含量的影响

碳源是植物组织培养不可缺少的物质，其不仅能给外植体提供能量，而且也能维持一定的渗透压[9]。由表2可以看出，不同碳源的培养基中培养雪莲细胞时细胞生长和黄酮产生有一定差异，效果最好的是蔗糖，培养后的细胞干重为25.3g/L，此时对应的黄酮含量最高，达到65.1mg/g；效果最差的是可溶性淀粉，培养后的细胞干重为11.3g/L，此时对应的黄酮含量降为55.1mg/g；葡萄糖、果糖和乳糖的效果较为接近。综合考虑，应该选择蔗糖作为碳源。

2.3 蔗糖浓度对雪莲细胞生长及黄酮含量的影响

表3 蔗糖浓度对雪莲细胞生长及黄酮含量的影响

碳源的种类及碳源的浓度大小不仅影响细胞的生长速度，而且还影响细胞的生长状态和总黄酮的生物合成[10]。由表3可以看出，不同蔗糖浓度的培养基中培养雪莲细胞时细胞生长和黄酮产生有一定差异；随着蔗糖浓度的增大，细胞干重先升高后降低，在蔗糖浓度为35 g /L时，细胞干重达到最大（25.6 g/L），而后逐渐下降，当蔗糖浓度增大到55 g /L时，细胞干重降到15.1 g/L；细胞中的黄酮含量的变化趋势与细胞干重的变化类似，在蔗糖浓度为35g /L时，黄酮含量达到最大（65.6 mg/g），而后逐渐下降，当蔗糖浓度升高到55 g /L时，黄酮含量降为55.9mg/g。综合考虑，应该选择的蔗糖浓度为30～40 g /L。

2.4 培养基 pH值对雪莲细胞生长及黄酮含量的影响

表4 培养基 pH对雪莲细胞生长及黄酮含量的影响

培养基pH值会影响其矿质元素的存在状态，从而影响植物对元素的吸收和利用[11]。由表4可以看出，不同pH值的培养基中培养雪莲细胞时细胞生长和黄酮产生有一定差异；随着pH值的升高，细胞干重先升高后降低，在pH值为5.5时，细胞干重达到最大（25.5 g/L），而后逐渐下降，当pH值升高到7.5时，细胞干重降到10.7 g/L；细胞中的黄酮含量的变化趋势与细胞干重的变化类似，在pH值为5.5时，黄酮含量达到最大（65.2 mg/g），而后逐渐下降，当pH值为7.5时，黄酮含量降到49.1 mg/g。综合考虑，应该选择的pH值范围为5.0～6.0。

2.5 正交试验

在单因素试验的基础上，选择总氮浓度、蔗糖浓度和pH 3个影响因素进行正交试验，以进一步优化培养基成分。正交试验因素水平表见表5，正交实验结果见表6。

表5 培养基优化的正交设计因素水平表

表6 培养基优化的正交设计及结果表

从极差分析可知，总氮浓度、蔗糖浓度和pH三因素对黄酮量的影响大小为A＞B ＞C，最佳培养基成分的组合为A2B1C1，即总氮浓度为40 g/L、蔗糖浓度为30 g/L、培养基pH为5.0为最佳条件。

2.6 验证试验

由于最佳组合不在正交表中，因此选取最佳组合A2B1C1进行验证试验，3次重复试验的结果见表7。

由表7可以看出，在此培养基中培养13天后，得到的细胞干重平均为25.9g/L，细胞黄酮含量平均为93.23mg/g，说明了试验结果具有可靠性。

3 结语

通过单因素试验研究了不同培养条件对天山雪莲细胞悬浮培养时干重和总黄酮含量的影响。结果表明，MS培养基中不同总氮浓度、蔗糖浓度、pH值下，天山雪莲细胞悬浮培养时干重和总黄酮含量均有一定差异。正交实验结果表明，最优的培养基为：MS培养基中总氮浓度为40 mmol /L、蔗糖浓度为30 g/L、培养基pH为5.0。在此条件下培养13天，雪莲细胞干重平均为25.9 g/L，细胞黄酮含量平均为93.23mg/g。