CQ复方对癌侵袭镜像痛模型小鼠的镇痛作用及其中枢机制探讨

姜宇懋+孙丹丹+王志国+李涛+赵小亮+焦玥+刘洋+李玉娟+欧阳竟锋+王丹巧

[摘要] 该研究旨在了解CQ复方对癌侵袭镜像痛（cancer invasion induced mirror image pain，CIIMIP）模型小鼠的鎮痛作用及其相关中枢机制。将雄性BALB/c小鼠随机分为正常组、操作对照组（注射0.2 mL灭活的S180肉瘤细胞液）、模型组（于右腿股骨大转子处注射0.2 mL S180肉瘤细胞液）、CQ复方低剂量组（模型+100 mg·kg-1，ip）、CQ复方中剂量组（模型+150 mg·kg-1，ip）、CQ复方高剂量组（模型+200 mg·kg-1，ip），造模前及术后用Von Frey纤维丝测定镜像侧后足的机械缩足阈值（mechanical withdrawal threshold，MWT）；采用高效液相-荧光法（HPLC-FLD）检测脊髓L3～L5节段内谷氨酸（Glu）、γ-氨基丁酸（GABA）、甘氨酸（Gly）、牛磺酸（Tau）浓度；采用AimPlex流式高通量多因子检测技术检测L3～L5节段脊髓组织内调节激活T细胞表达与分泌因子（RANTES）、单核细胞趋化蛋白（MCP-3）的含量；并观察GABAa受体拮抗剂（荷包牡丹碱）对CQ复方镇痛作用的影响。研究结果发现，CQ复方能够显著提高模型小鼠的MWT（P<0.01，P<0.05），降低L3～L5节段脊髓组织内兴奋性氨基酸Glu的含量（P<0.01，P<0.05），提高抑制性氨基酸GABA，Gly，Tau的含量（P<0.01，P<0.05），降低Glu/GABA比值（P<0.01，P<0.05），降低RANTES，MCP-3水平（P<0.05）。GABAa受体拮抗剂在2个时间点有意义地降低了CQ复方引起的MWT升高（P<0.05）。该研究结果表明，CQ复方对CIIMIP模型小鼠有显著的镇痛作用，其机制与调节中枢神经系统兴奋性氨基酸（EAA）/抑制性氨基酸（IAA）递质的平衡，部分激活GABAa受体，以及减少脊髓组织内促炎性细胞因子RANTES，MCP-3的释放有关。

[关键词] 癌侵袭镜像痛； CQ复方； 神经递质； GABAa受体； 促炎性细胞因子

[Abstract] This study aimed to analyze the analgesic effect and related central mechanisms of CQ prescription on cancer invasion induced mirror image pain （CIIMIP）in model mice.In the study， male BALB/c mice were randomly divided into normal group， operation control group （injected with 0.2 mL inactivated S180 sarcoma cell sap）， model group （injected with 0.2 mL S180 sarcoma cell sap on the right leg near the greater trochanter of femur） and CQ prescription low dose group （intraperitoneally injected with CQ prescription 100 mg·kg-1 on the basis of model mice）， CQ prescription middle dose group （intraperitoneally injected with CQ prescription 150 mg·kg-1 on the basis of model mice）， and CQ prescription high dose group （intraperitoneally injected with CQ prescription 200 mg·kg-1 on the basis of model mice）. Mechanical withdraw threshold （MWT） of the mirror image lateral hind paws were evaluated by Von Frey hairs before modeling and after surgery. The levels of glutamate （Glu）， gamma aminobutyric acid （GABA）， glycine （Gly）， and taurine （Tau） in the L3-L5 spinal cord were measured by the high performance liquid chromatography-fluorescence detector （HPLC-FLD）； AimPlex detection technology with multiple factors was used to detect the levels of regulated on activation in normal T-cell expressed and secreted （RANTES）， monocyte chemoattractant protein （MCP-3） in the L3-L5 spinal cord. Then we observed the influence of GABAa receptor antagonist （Bicuculline） on analgesic effect of CQ prescription.The results indicated that CQ prescription could remarkably increase MWT of model mice（P<0.01， P<0.05）， decrease the level of Glu（P<0.01， P<0.05）， improve the levels of GABA， Gly， Tau（P<0.01， P<0.05）， lower the ratio of Glu/GABA（P<0.01， P<0.05）， and reduce the levels of RANTES， MCP-3（P<0.05） in the L3-L5 spinal cord， and GABAa receptor antagonist significantly blocked the analgesic effect of CQ prescription at two time points（P<0.05）.This study showed that CQ prescription had significant analgesic effect on CIIMIP model mice， and its mechanism was associated with regulating the balance between excitability amino acid（EAA） and inhibitory amino acid （IAA） transmitters in central nervous system， partially activating GABAa receptor， and reducing the release of RANTES and MCP-3 in the spinal cord.

[Key words] cancer invasion induced mirror image pain； CQ prescription； neurotransmitters； GABAa receptor； proinflammatory cytokine

鏡像痛是指当躯体某一部位损伤后，除了损伤部位出现自发性疼痛或痛敏，有时还可导致身体对侧相同区域出现自发性疼痛或痛敏[1]。大量的临床和动物实验研究表明镜像痛是一个非常普遍的现象。在临床上，可观察到复杂区域疼痛综合征患者双侧肢体出现明显的异常疼痛现象[2]。在诸多实验动物模型上，如慢性压迫性损伤模型[3]，脊神经结扎模型[4]，实验性关节炎模型[5]，癌症疼痛模型[6-7]等都发现了镜像痛现象。然而，镜像痛的发生、发展和维持的机制尚不十分清楚，至今治疗效果仍不理想。其中，癌症疼痛出现的镜像痛既严重影响患者的生存质量又干扰癌症的治疗，在临床上是非常棘手的问题。

本课题组前期已证实CQ复方对于三叉神经痛模型大鼠具有明显的镇痛作用，且其作用机制与降低高级痛觉中枢纹状体内兴奋性氨基酸Glu的水平有关[8]。另外，也发现脊髓组织内Glu和GABA含量的平衡在癌侵袭镜像痛这种疼痛的传递机制中发挥着重要的作用[7]。因此，本文拟建立小鼠CIIMIP模型，观察CQ复方对模型小鼠MWT的影响；采用高效液相-荧光法、AimPlex流式高通量多因子检测等技术，测定L3～L5节段脊髓组织内Glu，GABA，Gly，Tau，RANTES，MCP-3的含量；研究GABAa受体抑制剂对CQ复方镇痛作用的影响。明确CQ复方对于癌侵袭镜像痛是否同样具有镇痛作用，并进一步深入探讨其可能的镇痛作用机制。为肿瘤侵袭引起的镜像痛的机制研究及临床治疗药物的开发提供参考。

1 材料

1.1 动物 SPF级BALB/c雄性小鼠，体重18～20 g，购于中国食品药品检定研究院，许可证号SCXK（京）2014-0013。

1.2 瘤株、药品及试剂 S180肉瘤细胞系由中国中医科学院中药研究所惠赠；CQ复方自制，由川芎提取物和青风藤提取物组成，其主要成分盐酸川芎嗪和盐酸青藤碱的质量比例为4∶5。Glu，GABA，Gly，Tau，硼酸，乙酸钠（Sigma公司）；甲醇、四氢呋喃（Fisher Chemicals公司）；邻苯甲醛（Aldrich公司）；β-巯基乙醇（Amresco公司）；荷包牡丹碱（Bicuculline，Bic）（Selleck公司）；Aimplex Muose Custom 8-plex kit多因子检测试剂盒（北京旷博生物技术有限公司）。

1.3 仪器 51000-20C Von Frey hairs 疼痛测试包（Danmic公司）；组织研磨仪（IKA，T10 basic ULTRA-TURRAX）；HPLC检测系统（Sykam S-2100，G1321 A荧光检测器，Agilent ZORBAX Eclipse AAA 色谱柱及化学工作站）；NovoCyte D1040 流式细胞仪（艾森生物有限公司）；台式高速离心机（Eppendorf，5417R）。

2 方法

2.1 分组、造模、行为学评价及药效观察 将冻存的S180肉瘤细胞注射于健康小鼠腹腔，使其产生癌性腹水，收取后分装冻存。冻存的腹水瘤细胞复苏后，台盼蓝染色计数，调整活细胞数为1×107个/mL，置于冰盒内备用。将上述小鼠连续3 d进行预刺激（0.16 g纤维丝刺激小鼠双侧的后足），第4天将右后足MWT ≥0.4 g的小鼠随机分为正常组（Native组，n=13）、假手术组（Sham组，n=11）、手术组（Surgery组，n=52）。Surgery组小鼠于右腿股骨大转子（相当于坐骨神经分支部位上方）注射0.2 mL瘤细胞液，Sham组于相同部位注射同等体积相同浓度灭活的瘤细胞液。瘤细胞灭活方法：沸水中煮沸15 min，经台盼蓝染色确定无活细胞。Native组不作任何操作。

采用机械触痛法测定小鼠的MWT[7，9]。术后第2，3，4，5，6，7天测评小鼠手术部位及对侧（镜像侧）后足的MWT，将术后5 ～ 7 d连续3 d MWT≤0.07 g视为造模成功，成模小鼠随机分为模型组（Model，n=12），CQ复方低剂量组（L-CQ，100 mg·kg-1，n=11）、CQ复方中剂量组（M-CQ，150 mg·kg-1，n=11）、CQ复方高剂量组（H-CQ，200 mg·kg-1，n=12）。各给药组于术后第8，9，10天腹腔注射相应剂量的药物，每天1次，Model，Sham及Native组腹腔注射等量的生理盐水。并于第10天给药前（即0 min）及给药后30，60，90，120，180，240 min这7个时间点测评癌侵袭镜像侧后足的MWT。

2.2 脊髓组织内氨基酸水平的检测 连续给药第3天，测得癌侵袭镜像侧后足的MWT后，将小鼠脱颈椎处死，置于冰块上，取L3～L5节段脊髓组织，称重。加入1 mL冰生理盐水，组织匀浆仪充分匀浆，后经去蛋白及微粒等前处理得到脊髓匀浆处理液，使用超纯水稀释至适当倍数待测。采用HPLC-FLD法检测稀释后的脊髓匀浆处理液中Glu，GABA，Gly，Tau这4种氨基酸的含量，并按脊髓组织质量折算为每1 mg组织内氨基酸的含量。具体检测方法如下：流动相为A液（缓冲液-甲醇-四氢呋喃400∶95∶5）及B液（缓冲液-甲醇120∶380），流速为0.8 mL·min-1，柱温30 ℃，进样体积20 μL。洗脱梯度：0～10 min为0%～63%B液；10～12 min为63%B液；12～17 min为100%B液；17～18 min为100%～0%B液；18～21 min为0%B液。衍生液于柱前自动衍生，激发波长为340 nm，发射波长为455 nm。

2.3 GABAa受体拮抗剂对CQ复方镇痛作用的影响 按2.1项方法进行动物模型的制备，术后第2～7 d测评小鼠癌侵袭镜像侧后足的MWT，并将后3 d MWT均≤0.07 g的成模小鼠分为模型组，GABAa受体拮抗剂（Bic）+CQ组及单用CQ复方组（n=11）。Bic+CQ组在给予CQ复方前15 min，经尾静脉注射Bic 2 mg·kg-1，以阻断GABAa受体。CQ复方经腹腔注射给药200 mg·kg-1。于Bic给药前（即-15 min）、CQ复方给药前（即0 min）及给药后30，60，90，120，180，240 min，测评小鼠癌侵袭镜像侧后足的MWT，观察GABAa受体阻断对CQ复方镇痛作用的影响。

2.4 脊髓组织内促炎性细胞因子含量的检测 采用AimPlex流式高通量多因子检测技术检测脊髓组织内RANTES，MCP-3的含量，脊髓组织内细胞因子的含量需进一步按脊髓组织质量折算为每1 mg组织内的含量。连续给药第3天，测得小鼠癌侵袭镜像侧后足的MWT后，取L3～L5段脊髓组织，称重。按照相关试剂盒操作说明，制备样品，将反应好的样品通过流式细胞仪配备的488 nm激发光的PE通道进行荧光检测上机读数。结合抗原标准品的标准曲线，对脊髓组织内RANTES，MCP-3进行定量检测。

2.5 统计学分析 采用SPSS 21.0软件，正态计量数据以±s表示，重复测量的MWT资料在具体某一时间点的组间比较采用多因素方差分析；对于检测指标的数据采用独立样本t检验；以P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 CIIMIP模型小鼠镜像侧后足的MWT变化 术后2～7 d连续评价Native组、Sham组及Surgery组小鼠癌侵袭镜像侧的MWT，发现Surgery组小鼠MWT在术后第2天下降，第4～7天均稳定维持在（0.042±0.013）～（0.072±0.037）g，显著低于Sham组和Native组（P<0.01），见图1，且Surgery组小鼠癌侵袭侧存在明显的痛敏现象。术后第11天解剖，发现Surgery组小鼠腿部肿瘤位于坐骨神经分支处，肿瘤生长进行性地压迫或侵袭坐骨神经，且该组小鼠左前肢和腹部在术前及术后16 d内均未见明显疼痛表现，表明S180肉瘤细胞所致的癌侵袭痛模型小鼠存在镜像痛现象。

3.2 CQ复方对CIIMIP模型小鼠镜像侧后足MWT的影响 连续第3天给药前后各组小鼠后足MWT测评结果见表1。CIIMIP模型小鼠镜像侧的MWT在所有时间点与Native和Sham组比较均显著降低（P<0.01）。H-CQ组的MWT在所有时间点与Model组比较均明显提高（P<0.01，P<0.05），M-CQ组的MWT从给药60 min开始与Model组比较均存在统计学意义（P<0.05），結果表明CQ复方对CIIMIP模型小鼠具有明显镇痛作用。

3.3 CIIMIP模型小鼠脊髓组织内EAA，IAA的含量以及CQ复方对其的影响 与Native组比较，Model组小鼠L3～L5段脊髓组织内兴奋性氨基酸Glu的含量明显升高（P<0.05），且CQ复方高、中、低剂量组能够显著降低模型小鼠脊髓组织内Glu的含量（P<0.01，P<0.05），并存在量效依赖关系，见表2。此外，与Native及Sham组比较，Model组小鼠脊髓组织内抑制性氨基酸GABA的含量均显著降低（P<0.01），且CQ复方高剂量组能够显著提高模型小鼠脊髓组织内GABA的含量（P<0.01）；与Native及Sham组比较，Model组小鼠脊髓组织内抑制性氨基酸 Tau的含量均显著降低（P<0.01），Model组小鼠脊髓组织内抑制性氨基酸Gly的水平明显低于Sham组（P<0.05），且CQ复方高剂量组能够显著提高脊髓组织内Gly，Tau的含量（P<0.01），CQ复方中剂量组能够明显提高脊髓组织内Tau的含量（P<0.05），见表2。经统计，与Native及Sham组比较，Model组小鼠脊髓组织内Glu/GABA的比值显著升高（P<0.01），且CQ复方高、中、低剂量组能够显著降低Glu/GABA的比值（P<0.01，P<0.05），见表2。

3.4 GABAa受体拮抗剂对CQ复方镇痛作用的影响 Bic是GABAa受体竞争性拮抗剂。预先静脉注射Bic，阻断GABAa受体，在CQ复方给药后180，240 min 2个时间点有意义地降低了CQ复方引起的MWT升高，与CQ组比较P<0.05，结果见图2。提示CQ复方可能部分通过激活GABAa受体而发挥镇痛作用。

4 讨论

CQ复方具有活血行气，祛风除湿，通络止痛的功效，其主要成分为青藤碱和川芎嗪。青藤碱是中药青风藤的主要成分之一，具有镇痛、抑制免疫、抗炎等作用[10-11]。川芎嗪是中药川芎的主要成分之一，具有镇静镇痛、神经保护、抗血栓等活性[12]。本课题组前期已证实CQ复方对于三叉神经痛模型大鼠具有明显的镇痛效应[8]。而本文通过对MWT的测评，进一步发现CQ复方对于CIIMIP模型小鼠同样具有显著的镇痛作用（P<0.01，P<0.05），为了更清楚地认识CQ复方对其的镇痛活性，检测了相关氨基酸类神经递质、促炎性细胞因子在中枢神经系统中脊髓组织内的水平变化，并探讨了其可能的作用靶点。

目前，被广泛接受的镜像痛形成机制主要有三大假说，分别是胶质细胞学说、神经学说、体液学说。其中，中枢神经系统胶质细胞激活，通过缝隙连接、钙波及促炎性细胞因子的释放参与镜像痛发生的胶质细胞学说在镜像痛发生机制中受到越来越多的关注[13-16]。

中枢神经系统内广泛分布的氨基酸类神经递质主要分为2类，一类是兴奋性氨基酸包括Glu等，另一类是抑制性氨基酸包括GABA，Gly，Tau等。研究表明，在疼痛状态下，过量的兴奋性氨基酸Glu由初级传入神经纤维末端释放，激活脊髓背角神经元细胞膜上的NMDA受体，引起大量Ca2+内流，并以这种钙波的形式，促使神经元发生去极化，产生痛觉过敏[17]。另有文献报道，抑制性氨基酸GABA，Gly能够与其相应受体结合，通过增加Cl离子向细胞内的流动，抑制脊髓背角介导的神经元兴奋性反应以及疼痛信号的输出[18]。此外，抑制性氨基酸Tau还可以通过直接作用于三叉神经脊束核尾侧亚核胶状质的突触后神经元，活化GABA，Gly受体调节口面部疼痛[19]。作者检测了CIIMIP模型小鼠L3～L5段脊髓组织内相关兴奋性氨基酸和抑制性氨基酸神经递质的含量，发现该模型小鼠脊髓组织内Glu的水平明显升高（P<0.05），GABA，Gly，Tau的水平则显著降低（P<0.01，P<0.05），而CQ复方可以逆转上述情况的发生，显著降低Glu/GABA比值（P<0.01，P<0.05），与上述研究的结果一致，提示了兴奋性和抑制性氨基酸类神经递质均参与CIIMIP的发生机制，CQ复方则可能通过对其的调控，调节中枢神经系统内EAA/IAA的平衡，发挥镇痛作用。进一步通过观察GABAa受体拮抗剂对CQ复方镇痛作用的影响，发现预先使用GABAa受体拮抗剂一定程度地降低了CQ复方的镇痛作用，表明CQ复方不仅在脊髓兴奋性和抑制性氨基酸递质水平发挥作用，而且可能部分通过激活GABAa受体介导其镇痛作用的发挥。然而，CQ复方是否作用于GABA受体的其它亚型？是否作用于Glu受体以及具体作用于哪种亚型？尚需进一步深入研究。

促炎性细胞因子RANTES，MCP-3均属于趋化因子中CC家族成员。文献报道，敲除RANTES基因能减轻坐骨神经部分结扎诱导的痛觉过敏，抑制损伤神经中巨噬细胞浸润，增加白细胞介素-4（IL-4），IL-10等抗炎因子的表达，从而参与神经病理性疼痛的调控[20]。另有报道，坐骨神经部分结扎可诱导脊髓星形胶质细胞MCP-3的表达提高，从而通过CC家族受体2（CCR2）参与痛觉传递[21]。本研究发现，CQ复方可以明显降低模型小鼠脊髓组织内RANTES，MCP-3的水平（P<0.05）。提示CQ复方通过降低中枢神经系统内相关促炎性细胞因子的释放，抑制疼痛信号的传递，这可能作为另一种途径参与其镇痛作用的机制。

本实验中CQ复方对CIIMIP模型小鼠显示了明显的镇痛作用及良好的量效依赖性，但对脊髓L3～L5节段内相关氨基酸类神经递质和炎性细胞因子水平的影响，量效关系只出现了一定趋势，线性不十分良好。其原因可能与实验动物间的个体差异有关，也可能与实验用药为多成分药物，其作用机制亦可能为多途径、多环节、多靶点有关。故对上述检测指标的相关因素及其更详尽、深入的机制研究尚待开展。

综上所述，本文通过建立CIIMIP小鼠模型，明确了CQ复方对CIIMIP的镇痛作用，并观察到此作用可能与调节中枢神经系统中脊髓组织内相关兴奋性/抑制性氨基酸递质的平衡，部分激活GABAa受体有关。同时，抑制相关促炎性细胞因子的释放也是CQ复方发挥镇痛作用的相关机制之一。该研究为CIIMIP相关发生机制的深入研究提供了参考，也为CQ复方应用于临床治疗癌症侵袭镜像痛提供了一定的药理学依据。

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