低分子柑橘果胶对子宫内膜癌细胞株Ishikawa中Caspase-3蛋白表达影响

刘玲，张岩，魏力

(中国医科大学第四附属医院，沈阳 110000)

·基础研究·

低分子柑橘果胶对子宫内膜癌细胞株Ishikawa中Caspase-3蛋白表达影响

刘玲，张岩，魏力

(中国医科大学第四附属医院，沈阳110000)

目的观察低分子柑橘果胶(LMCP)对子宫内膜癌细胞株 Ishikawa中半胱氨酸门冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)表达的影响。方法①将Ishikawa细胞随机分为A、B、C、D组，分别加入终浓度为0、100、300、500 nmol/L 的LMCP培养24 h，用Western blotting法检测各组Caspase-3。②将Ishikawa细胞随机分为1、2、3、4组，加入终浓度为300 nmol/L的LMCP分别培养0、6、12、36 h，用Western blotting法检测各组Caspase-3。结果A、B、C、D组Ishikawa细胞中Caspase-3蛋白表达量分别为0.30±0.01、0.32±0.01、0.77±0.01、0.79±0.01。Caspase-3蛋白表达量A组

低分子柑橘果胶；子宫内膜癌；半胱氨酸门冬氨酸蛋白酶-3；细胞凋亡

Abstract:ObjectiveTo observe the influence of low modified citrus pectin (LMCP ) on the protein expression of Caspase-3 in endometrial cancer cells Ishikawa.Methods① The endometrial cancer cells Ishikawa were randomly divided into four groups: groups A, B, C, and D, which were added with 0, 100, 300, 500 nmol/ LLMCP and then were cultured for 24 h. After that, the protein expression of Caspase-3 was detected by Western blotting. ② The endometrial cancer cells Ishikawa were randomly divided into four groups: groups 1, 2, 3, and 4, which were added with 300 nmol/L LMCP and then were cultured for 0, 12, 24, and 36 h, respectively. The expression of Caspase-3 was deteced by Western blotting.ResultsThe protein expression of Caspase-3 was 0.30±0.01, 0.32±0.01, 0.77±0.01, and 0.79±0.01 in the groups A, B, C, and D, respectively, and the order was as follows: group A

Keywords: low modified citrus pectin; endometrial carcinoma; Caspase-3; apoptosis

肿瘤细胞表面半乳糖凝素(Gal-3)与肿瘤转移过程中细胞黏附和聚集功能密切相关, 多种高转移性肿瘤细胞均能高表达 Gal-3[1]。低分子柑橘果胶 (LMCP) 的主要成分半乳糖能有效封闭和阻断 Gal-3 的功能表达[2]，且因其分子质量和酯化 度较低，无分支，易被肠道吸收，并可进入血液循环，有良好的应用前景[3]。但是目前LMCP抗肿瘤效果的研究未涉及子宫内膜癌。天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)与肿瘤细胞凋亡密切相关。本研究观察了LMCP对子宫内膜癌细胞株Ishikawa中凋亡蛋白 Caspase-3表达的影响，探讨用LMCP促进子宫内膜癌细胞凋亡的可能性。

1 材料与方法

1.1 材料 人子宫内膜癌细胞株 Ishikawa 细胞 由中国医科大学细胞生物教研室提供，在含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的DMEM培养基中贴壁生长，于37 ℃、5%CO2培养箱中加0.125%胰酶+0.020%EDTA 传代培养；果胶购于浙江果园康品生物科技有限公司；RPMI1640 培养基购于Sigma公司；CO2培养箱CB115 为德国WTB-binder公司生产；小鼠抗人Caspase-3一抗由碧云天生物技术研究所提供;碱性磷酸酶标记的马抗小鼠及山羊抗兔第二抗体、碱性磷酸酶显色试剂盒均购于北京中山生物技术有限公司；胎牛血清购于美国Hyclone公司。

1.2 LMCP的制备 称取果胶30 g，置于5 L三角瓶 中，加少量95%乙醇湿润，然后加入3 L沸水，搅拌溶解。待果胶溶解完全后，经100目滤布过滤，滤液进行旋转蒸发，浓缩至原液的1/3。浓缩后的果胶液经121 ℃高温处理30 min，自然冷却后于-20 ℃冰箱中冷冻2～3 h，再于-78 ℃冰箱中冷冻3 h，最后进行冷冻干燥，样品粉碎后即得到 LMCP，留取备用，以蒸馏水调节实验中所需浓度。

1.3 不同浓度LMCP培养24 h的子宫内膜癌细胞株 Ishikawa中Caspase-3蛋白表达观察 取对数生长期的 Ishikawa细胞，胰酶消化、计数，调整密度为1×105/ mL，接种于6 cm2的培养皿中，在37 ℃、5%CO2、饱和湿度的条件下恒温培养。细胞培养达到12h后吸出旧培养液，每皿加入3 mL无血清培养液，12 h后吸出培养液。设A、B、C、D组，分别加入终浓度为0、100、300、500 nmol/L 的LMCP继续培养，每组5个复孔，24 h后常规收集细胞。采用Western blotting法检测各组Caspase-3。收集到的细胞用PBS洗3次，冰上裂解20 min后匀浆，15 000 r/min离心15 min,取上清，10%SDS-PAGE分离蛋白质，电泳后将PAGE凝胶中的蛋白通过电转移槽转移至PVDF膜(40 ℃)。取出膜用丽春红染色，TBST封闭，加入一抗(1∶400稀释)4 ℃孵育24 h，15 mL TBST洗3次，加入二抗(1∶2 000)室温孵育2 h，15 mL TBST洗3次,DAB法显色。以GAPDH为内参照。各组Caspase-3表达量以Caspase-3条带灰度值与GAPDH灰度值之比表示。实验重复3次，取平均值。

1.4 300 nmol/L的LMCP培养不同时间后子宫内膜癌细胞株 Ishikawa中Caspase-3蛋白表达观察 设1、2、3、4组，加入300 nmol/L的LMCP分别培养0、6、12、36 h，其余同1.3。

2 结果

2.1 不同浓度LMCP培养24 h的Ishikawa细胞中Caspase-3蛋白表达量比较 A、B、C、D组Ishikawa细胞中Caspase-3蛋白表达量分别为0.29±0.06、0.38±0.06、0.40±0.06、0.42±0.06。Caspase-3蛋白表达量A组

2.2 300 nmol/L的LMCP培养不同时间的Ishikawa细胞中Caspase-3蛋白表达量比较 1、2、3、4组Ishikawa细胞中Caspase-3蛋白表达量分别为0.30±0.01、0.32±0.01、0.77±0.01、0.79±0.01。Caspase-3蛋白表达量1组<2组<3组<4组，P均<0.05。

3 讨论

本研究结果显示，LMCP能增强子宫内膜癌细胞Ishikawa中凋亡蛋白 Caspase-3表达，且此效果有剂量(0～500 nmol/L)和时间(0～36 h)依赖性。Caspase-3是凋亡蛋白家族的重要成员，与肿瘤细胞的分化增殖及浸润转移密切相关[4]。体外实验证实，LMCP做为Gal-3的抑制剂，能够通过抑制肿瘤细胞同型聚集，进而抑制肿瘤血管生成，并减弱肿瘤细胞与内皮细胞黏附作用[5]，发挥抗肿瘤作用。国内学者张岩等[6,7]通过研究验证，Gal-3在正常子宫内膜向子宫内膜腺癌转化的过程中表达逐渐升高，其在子宫内膜腺上皮的恶性转化过程中，作为细胞增殖、黏附的调节因素，参与了子宫内膜腺上皮的癌变，同时该学者还经实验印证Gal-3及MMP-9在正常增生期子宫内膜组织(NE)、不典型增生组织(AH)及子宫内膜腺癌组织(EC)中的表达逐渐增高,二者在EC组及AH组表达明显高于NE组，Gal-3的表达随肿瘤的分化降低而增加,在低分化癌中表达明显高于高分化腺癌。Wang等[8]发现经LMCP作用后胃癌和结直肠癌SW-480细胞系的细胞活性明显降低，细胞异体移植瘤的体积明显小于对照组，同时LMCP能降低Gal-3的表达水平，抑制生存蛋Survivin的表达，促进细胞凋亡。Lu等[9]证实LMCP能增强奥沙利铂对人结肠癌细胞的抑制作用，增强凋亡蛋白Caspase-3、9的表达。Hsieh等[10]发现LMCP能抑制人类前列腺JCA-1细胞的生长，并且能使该细胞中与癌症转移相关的nm23基因呈稳定低态表达。国内学者汪峰等[11]通过研究发现LMCP 能增加奥沙利铂对HCT116细胞增殖的抑制作用，该效应可能与细胞周期的调节以及活化线粒体凋亡途径有关。黄志良等[12]研究发现通过建立小鼠结肠癌肝转移模型，高浓度LMCP 组肝转移灶数目及肿瘤体积均明显小于对照组，LMCP 能明显抑制结肠癌肝转移。Hsieh等[10]早期的研究表明LCP可能通过下调cyclin B细胞和Cdc2影响前列腺JCA-1的细胞周期调，进而导致G2/M期细胞积聚及随后的细胞凋亡。此后，Streetly等[13]证实顺铂单药与顺铂、低分子柑橘果胶联合用药均能人肺癌细胞A549细胞凋亡比例增加,联合组较单药组细胞凋亡更加显著，单药组与联合组A549细胞的凋亡相关蛋白procaspase-3、8、9蛋白的表达均下调,联合组较单药组procaspase-3、9蛋白表达下调更为显著。刘海鹰等[14]在小鼠结肠癌肝转移模型中研究发现，高浓度低分子柑橘果胶组肝转移灶数目明显低于阳性对照组(P<0.05)，阳性对照组和各治疗组血清Gal-3浓度均明显高于阴性对照组(P均<0.01)，该实验得出结论Gal-3在结肠癌肝转移中呈高水平表达，低分子柑橘果胶能明显抑制结肠癌的肝转移。

目前国内外未见对LMCP在妇科肿瘤应用效果的报道。本研究填补了这一空白，同时本研究结果也提示，LMCP可以促进子宫内膜癌细胞凋亡，说明其有明确的抑制子宫内膜癌细胞增殖的作用。考虑到LMCP的提炼成本较低，社会来源广泛，笔者认为LMCP在子宫内膜癌治疗中的应用具有很大的研究前景。

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Influence of low modified citrus pectin on protein expression of Caspase-3 in endometrial cancer cells Ishikawa

LIULing,ZHANGYan,WEILi

(TheFourthAffiliatedHospitalofChinaMedicalUniversity,Shenyang110000,China)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.35.008

R737.33

A

1002-266X(2017)35-0026-03

2017-02-15)

辽宁省自然科学基金项目(2015020482)。

张岩(E-mail：cmu4h-zhy@126.com)