FAM96A在人肝癌组织中表达及其对肝癌HepG2细胞增殖和凋亡的影响

廖宇圣，张姮，黄曼玲，田俊

(1华中科技大学同济医学院附属武汉市中心医院, 武汉 430070；2华中科技大学同济医学院基础医学院)

FAM96A在人肝癌组织中表达及其对肝癌HepG2细胞增殖和凋亡的影响

廖宇圣1，张姮1，黄曼玲1，田俊2

(1华中科技大学同济医学院附属武汉市中心医院, 武汉 430070；2华中科技大学同济医学院基础医学院)

目的观察96序列相似的家庭成员A(FAM96A)在人肝癌组织中的表达并探讨其对人肝癌细胞系HepG2细胞增殖及凋亡的影响。方法采用实时荧光定量聚合酶链反应及免疫印迹法检测FAM96A蛋白在肝癌组织和癌旁组织、HepG2细胞和L02细胞中的mRNA及蛋白表达量。采用脂质体转染法将含人FAM96A全长序列的pcDNA3.1-myc-FAM96A重组质粒转染至HepG2细胞中，取对数生长期的HepG2细胞，24 h后分为FAM96A组和对照组，分别转染pcDNA3.1-myc-FAM96A质粒和pcDNA3.1-vector空白质粒。采用MTT法及流式细胞技术检测两组HepG2细胞增殖活力和凋亡率。结果FAM96A mRNA在肝癌组织、癌旁组织中的相对表达量分别为0.704±0.178、1.707±0.267,在HepG2细胞、L02细胞中的相对表达量分别为0.627±0.251、1.654±0.285，两者比较，P均lt;0.05。FAM96A蛋白在肝癌组织中的表达低于癌旁组织、在HepG2细胞中的表达低于L02细胞，P均lt;0.05。FAM96A组细胞增殖活力低于对照组(Plt;0.05)，FAM96A组、对照组细胞凋亡率分别为33.06%±3.15%、5.08%±0.75%，两组比较，Plt;0.05。结论FAM96A在人肝癌组织中表达下降，过表达FAM96A可抑制肝癌细胞增殖且诱导其凋亡。

肝肿瘤；96序列相似的家庭成员A;细胞增殖; 细胞凋亡

原发性肝细胞癌(简称肝癌)是我国常见的恶性肿瘤之一[1]。肝癌的病死率在癌症相关死因中位列第三，5年生存率仅为10%,复发和转移是导致患者长期生存率较低的主要原因，机制不明[2，3]。肝癌的发生发展是癌基因激活或(和)抑癌基因失活在内的多阶段多步骤过程。96序列相似的家庭成员A (FAM96A) 是普遍存在、高度保守的凋亡激活蛋白，其生物学功能尚不明确[4]。目前国内外关于FAM96A 的研究报道甚少，FAM96A在肝癌发生发展中的功能未知。2015年1月～2016年12月，我们观察了FAM96A在肝癌组织和细胞中的表达差异,并探讨其对肝癌细胞系HepG2细胞增殖、凋亡的影响，以期为寻找肝癌新的治疗靶点提供依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取华中科技大学同济医学院附属武汉市中心医院2015年1月～2016年12月的48例人肝癌组织及配对癌旁(距肿瘤边缘gt;2 cm)组织标本，患者男34例、女14例，年龄≤50岁30例，gt;50岁18例；肿瘤直径：≤5 cm 18例，gt;5 cm 30例；肿瘤数目：单发31例，多发17例；乙肝表面抗原：阳性41例，阴性7例；肝硬化：有38例，无10例；血清AFP：≤20 ng/mL 15例，gt;20 ng/mL 33例；门静脉癌栓：有13例，无35例；肝外转移:阳性8例，阴性40例；Child分级：A级39例，B级9例；BCLC分期:A期28例，B+C期20例。标本均经本院病理科诊断证实为原发性肝癌。48例肝癌组织标本及配对的癌旁组织标本离体后立即置入液氮中保存。标本的获取均得到患者本人及家属同意，并通过我院伦理委员会批准。

1.2 FAM96A mRNA表达检测 采用Real-time PCR法。按照TRIzol试剂盒操作说明书提取48例肝癌组织及配对癌旁组织、L02细胞、HepG2细胞的总mRNA。人肝癌细胞系HepG2细胞、人正常胎肝L02细胞均保存于本院中心实验室。FAM96A正向引物：5′-GCAAAGCACGCTGGAACT-3′，反向引物：5′-GGCCGAGACAAGCCTAAA-3′；β-actin正向引物：5′-TGAGACCTTCAACACCCCAG-3′，反向引物：5′-GCCATCTCTTGCTCGAAGTC-3′。均由上海英骏生物工程技术服务公司设计并合成。利用逆转录试剂盒将mRNA逆转录成cDNA，低温保存备用。Real-time PCR总反应体系为20 μL，其中2×SYBR Green mix缓冲液10 μL，正反向引物各0.6 μL(浓度为10 μmol/L)，cDNA 2 μL，DEPC水补齐至20 μL。反应条件：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性20 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s；共35个循环；72 ℃终延伸5 min。每个样本均做3个复孔，并重复3次。各组中FAM96A的相对表达量通过2-ΔΔCt法进行计算。

1.3 FAM96A蛋白表达检测 采用Western blotting法。分别称取0.08 g肝癌组织和癌旁组织，收集L02细胞及HepG2细胞，加800 μL全蛋白提取液提取蛋白，Bradford法蛋白定量。各组取120 μg上样于5.0%浓缩胶，15%分离胶，行SDS-PAGE电泳分离。转移蛋白于PVDF膜，5%脱脂奶粉稀释的FAM96A及β-actin一抗封闭，4 ℃过夜，HRP标记二抗，37 ℃温育,化学发光法显影检测蛋白表达。免疫印迹条带的灰度值经灰度扫描仪分析后获得。

1.4 HepG2细胞增殖活力检测 采用MTT法。取对数生长期的HepG2细胞接种于96孔板,每孔约100 μL，24 h后转染，分为FAM96A组和对照组，分别转染pcDNA3.1-myc-FAM96A质粒、pcDNA3.1-vector空白质粒。DMEM培养基(含10%FBS)培养1～4 d，每孔加5 mg/mL的MTT溶液20 μL，孵育1 h后弃上清液，每孔加DMSO 150 μL，酶标仪检测490 nm处各孔吸光度(A)值，绘制细胞生长曲线，其中横坐标为时间，纵坐标为A值。

1.5 HepG2细胞凋亡率检测 收集细胞，按照说明书加Annexin V-FITC 5 μL和PI 5 μL混匀，用流式细胞仪检测FITC,利用CellQuest软件获取并计算细胞凋亡率。

2 结果

2.1 FAM96A在肝癌、癌旁组织中的表达比较 FAM96A mRNA在肝癌、癌旁组织中的相对表达量分别为0.704±0.178、1.707±0.267,二者比较，P=0.000。FAM96A蛋白在肝癌、癌旁组织中的相对表达量分别为0.701±0.207、1.452±0.262，二者比较，P=0.000。

2.2 FAM96A在HepG2细胞、L02细胞中的表达比较 FAM96A mRNA 在HepG2细胞、L02细胞中的相对表达量分别为0.627±0.251、1.654±0.285,二者比较，P=0.000。FAM96A蛋白在HepG2细胞、L02细胞中的相对表达量分别为0.612±0.245、1.375±0.271，二者比较，P=0.000。

2.3 HepG2细胞增殖活力比较 转染第1天，FAM96A组、对照组A值分别为0.152±0.031、0.156±0.037；转染第2天，A值分别为0.305±0.039、0.412 ±0.036；转染第3天，A值分别为0.432±0.094、0.714±0.054；转染第4天，A值分别为0.604±0.061、0.902±0.063；转染第2～4天，FAM96A组A值低于对照组(P均lt;0.05)。

2.4 HepG2细胞凋亡率比较 FAM96A组、对照组细胞凋亡率分别为33.06%±3.15%、5.08%±0.75%，两者比较，P=0。

3 讨论

FAM96A与FAM96B属同源蛋白，通过与其相互作用蛋白复合而发挥功能。研究[4]表明，FAM96A、FAM96B、CIA1及胞质铁硫蛋白簇聚集系统的靶因子MMS19组成蛋白复合物发挥作用。FAM96B-CIA1-MMS19蛋白复合物促进多数胞质-胞核铁硫蛋白的组装。FAM96A-CIA1蛋白复合物特异性促进铁调节蛋白1成熟，从而维持细胞铁稳态。目前国内外对FAM96B的功能研究已取得突破性进展[5～8]，然而关于FAM96A的研究报道甚少。

在肿瘤组织及其相应邻近正常组织的差异性表达是分析基因与肿瘤关系的基础，异常表达的基因可能在肿瘤形成中扮演重要角色，可认为是潜在的新一类控制细胞增殖和凋亡的癌基因和抑癌基因[9]。本研究中Real-time PCR和Western blotting检测结果均显示FAM96A在肝癌组织中的表达低于癌旁组织，差异有统计学意义，且在人肝癌细胞系HepG2中的表达低于人正常胎肝细胞系L02，差异有统计学意义。可见,FAM96A在肝癌发生发展过程中扮演重要角色。可能是抑癌基因通过间接作用抑制肝癌和其他肿瘤的发生发展。Zhang等[10]从动物水平探索FAM96A功能，建立H22荷瘤模型，观察FAM96A对小鼠的抑瘤作用，研究结果表明FAM96A抑制肿瘤细胞生长，诱导细胞凋亡。本研究分别从人体组织标本及人肝癌细胞系两方面证实FAM96A可能是潜在抑癌基因，在肝癌发生发展中发挥抑制作用。与国外文献报道基本一致。

目前，研究[11]认为基因克隆、基因转染是明确基因功能的主要方法。肝癌HepG2细胞容易获得及培养，且转染效率高。因此，本研究将FAM96A质粒通过脂质体转染法转染至HepG2细胞中，观察FAM96A基因过表达对肝癌细胞生物学功能的影响。本研究中，MTT实验结果提示FAM96A组细胞的增殖速度低于对照组，即过表达FAM96A可抑制肝癌细胞增殖，流式细胞仪检测结果显示过表达FAM96A可诱导HepG2细胞凋亡。

本研究结果表明，FAM96A在肝癌组织及肝癌细胞系HepG2表达下降，且抑制HepG2细胞增殖，并诱导其凋亡。因此，FAM96A可作为一种新的抑癌基因而抑制肝癌的发生发展。

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ExpressionofFAM96AinhumanlivercancertissuesanditseffectonproliferationandapoptosisofhumanlivercancerHepG2cells

LIAOYusheng1,ZHANGHeng,HUANGManling,TIANJun

(1TheCentralHospitalofWuhanAffiliatedtoTongjiMedicalCollegeofHuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430070,China)

ObjectiveTo investigate the expression of family with sequence similarity 96 member A(FAM96A)in the liver cancer tissues and to evaluate its effects on the cell proliferation and apoptosis of human liver cancer cells HepG2.MethodsReal-time PCR and Western blotting were applied to detect the mRNA and protein expression levels of FAM96A in the liver cancer tissues and their adjacent tissues, HepG2 cells and L02 cells. Furthermore, the recombinant plasmid of pcDNA3.1-myc-FAM96A containing the whole sequence of human FAM96A gene (FAM96A group) and pcDNA3.1-vector pcDNA3.1-vector blank plasmid (control group) were respectively transfected into HepG2 cells. Then MTT essay and flow cytometry were applied to detect the proliferation and apoptosis rate of HepG2 cells in the two groups.ResultsFAM96A mRNA levels were significantly decreased in the liver tissues than in the adjacent tissues (0.704±0.178 vs. 1.707±0.267) and in HepG2 cells than in L02 cells (0.627±0.251 vs. 1.654±0.285), (bothPlt;0.05). While FAM96A protein expression levels were lower in the liver tissues as compared with those of the adjacent tissues and were lower in HepG2 cells than in L02 cells ( bothPlt;0.05). Moreover, MTT assay showed that the proliferation of the FAM96A group was significantly lower than that of the control group (Plt;0.05). FACS analysis indicated that the apoptotic rate was higher in the FAM96A group than in the control group (33.06%±3.15% vs. 5.08%±0.75%), (Plt;0.05).ConclusionThe FAM96A expression is significantly decreased in the liver cancer tissues and overexpression of FAM96A can inhibit the proliferation and induce the apoptosis of HepG2 cells.

liver neoplasms; family with sequence similarity 96 member A (FAM96A); cell proliferation; apoptosis

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.41.003

R735.7

A

1002-266X(2017)41-0009-03

国家自然科学基金资助项目(81350006)。

廖宇圣(1977-),男，医学硕士，副主任医师，主要研究方向为FAM96A与FAM96B在消化系统肿瘤中的表达及功能研究。E-mail：63669165@qq.com

张姮(1973-)女，医学博士，主任医师，主要研究方向为FAM96A与FAM96B的功能与机制研究。E-mail：653262549@qq.com

2017-07-12)