草果挥发油联合环磷酰胺对肝癌细胞增殖的影响

时海荣，杨扬,2

(1桂林医学院, 广西桂林 541004;2广西肝脏损伤与修复分子医学重点实验室)

·基础研究·

草果挥发油联合环磷酰胺对肝癌细胞增殖的影响

时海荣1，杨扬1,2

(1桂林医学院, 广西桂林 541004;2广西肝脏损伤与修复分子医学重点实验室)

目的探讨草果挥发油联合环磷酰胺对人肝癌HepG2细胞增殖的影响。方法取对数生长期的HepG2细胞，随机分为草果挥发油组、环磷酰胺组、联合组及对照组，草果挥发油组加入不同浓度的草果挥发油(终浓度为10、20、30、40 μg/mL)，环磷酰胺组加入不同浓度的环磷酰胺(终浓度为10 、20 、40、60 、80 μg/mL)处理；联合组加入不同浓度的草果挥发油(终浓度为10、20、30 、40 μg/mL)和环磷酰胺(终浓度为10 、20 、40 、60 、80 μg/mL)处理；对照组加入相应量的DMSO处理，采用MTT法测算各组细胞生长抑制率和协同指数(Q)。结果草果挥发油组、环磷酰胺组HepG2细胞增殖受到抑制，随着作用浓度的升高，细胞生长抑制率增高，呈浓度依赖性；联合组Q值≥0.85。结论草果挥发油在体外可发挥协同增强环磷酰胺抑制肝癌细胞增殖的作用。

肝癌；草果挥发油；环磷酰胺；细胞增殖

草果又名草果子、草果仁，为姜科豆蔻属多年生草本植物草果的干燥果实，是一种药食同源植物，主要分布于我国广西、四川、云南和贵州等地，其味辛，性温，具有消食化积，祛痰截疟，燥湿除寒等功效[1]。近年来多集中于对其挥发油提取方法、化学成分和生物活性的研究。研究者在分析草果挥发油成分组成的同时发现其具有抗菌、抗肿瘤作用，尤其是在体内外均能抑制肝癌细胞增殖[2～4]。环磷酰胺是常用的抗肝癌化疗药物，但由于耐药性和不良反应，临床应用受限。2016年6～12月，我们探讨草果挥发油与环磷酰胺联合用药对人肝癌HepG2细胞增殖的抑制作用，旨在探讨草果挥发油对常用抗肝癌药物的增敏效果，为草果挥发油进一步开发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料 草果挥发油由本实验室提取纯化；环磷酰胺(百灵威)；96孔板(JET-BIOFIL)；DMEM(Gibco)；胎牛血清(Hyclone)；青霉素(华北制药股份有限公司)；链霉素(山东鲁抗医药股份有限公司)；人肝癌细胞系HepG2细胞株(由桂林医学院药理实验室提供)；MTT粉末(Amresco)；二甲基亚砜(Amresco)；胰酶(吉诺生物医药技术有限公司)。酶联免疫检测仪(美国Bio-Tek公司)；倒置显微镜(日本OLYMPUS)；CO2恒温细胞培养箱(MCO-15AC日本三洋)；恒温水浴锅(金坛恒丰仪器厂)；洁净工作台(上海智城分析仪器制造有限公司)；电热恒温鼓风干燥(重庆银河试验仪器有限公司)；微量振荡器(江苏泰县医疗器械厂)。

1.2 细胞培养 HepG2细胞培养于含 10%胎牛血清，青霉素100 μg/mL 和链霉素100 μg/mL的DMEM高糖培养基中，于 37 ℃、5%CO2培养箱中静置培养。待细胞生长至 80%～90%时常规消化传代，每2～3 d传代 1次，取对数生长期的细胞进行实验[5]。

1.3 细胞形态观察及细胞生长抑制率测算 采用MTT法。取对数生长期的HepG2细胞，经胰酶消化后制成单细胞悬液(浓度为5×104/mL)，将细胞接种于96孔板中，每孔100 μL，培养24 h。将HepG2细胞随机分为草果挥发油组、环磷酰胺组、联合组及对照组，草果挥发油组加入不同浓度的草果挥发油(终浓度为10、20、30、40 μg/mL)，环磷酰胺组加入不同浓度的环磷酰胺(终浓度为10 、20 、40、60 、80 μg/mL)处理；联合组加入不同浓度的草果挥发油(终浓度为10、20、30 、40 μg/mL)和环磷酰胺(终浓度为10 、20 、40 、60 、80 μg/mL)处理；对照组加入相应量的DMSO处理[6]。培养24 h后镜下观察各组细胞形态后加入MTT(每孔20 μL)，4 h后，弃去原培养液，加入100 μL DMSO，置于微量振荡器上振荡10 min；于波长490 nm处测其吸光度(A)值，计算抑制率。每个浓度设3个复孔，重复 3 遍。细胞生长抑制率=[1- (实验组平均A值-空白对照组A值)/(对照组平均A值-空白对照组A值) ]×100%[7]。根据实验数据采用金正均法[8]计算两药协同作用的指数Q值，公式为：Q=EAB/(EA+EB-EA×EB)，判断两药相互作用的性质[9]。EA、EB为单独用药所得到的抑制率，EAB为联合用药所得到的抑制率。当0.85≤Q≤1.15时，两药联用表现为简单的相加作用；当Qgt;1.15时，联合用药具有协同作用；当Qlt;0.85时，联合用药表现为拮抗作用。

2 结果

2.1 细胞形态 细胞在未经药物处理之前，呈长梭形贴壁生长。24 h后草果挥发油组、环磷酰胺组的细胞形态发生改变，数目减少，部分细胞呈球形，大小不等；24 h后联合组的细胞数目剧减，细胞脱壁成悬浮状，可见较多碎片及死亡细胞。

2.2 各组细胞生长抑制率比较 草果挥发油和环磷酰胺能在一定程度上抑制细胞增殖，且呈浓度依赖性。草果挥发油组10、20、30 、40 μg/mL草果挥发油处理HepG2细胞后细胞生长抑制率分别为6.3%±1.1%、22.8%±1.8%、35.0%±2.1%、41.0%±3.4%，与对照组比较,P均lt;0.05。环磷酰胺组10 、20 、40、60 、80 μg/mL环磷酰胺处理HepG2细胞后细胞生长抑制率分别为5.5%±0.9%、7.0%±1.2%、7.6%±0.8%、8.2%±1.0%、12.1%±1.6%，不同浓度间细胞生长抑制率与对照组比较,P均lt;0.05。联合组10 μg/mL草果挥发油与10 、20 、40、60 、80 μg/mL环磷酰胺处理后细胞生长抑制率分别为14.7%±0.7%、19.5%±1.2%、27.1%±1.5%、30.7%±2.1%、42.6%±2.4%，与草果挥发油组10 μg/mL草果挥发油作用后的细胞生长抑制率比较，P均lt;0.05。联合组20 μg/mL草果挥发油与10 、20 、40、60 、80 μg/mL环磷酰胺处理HepG2细胞后细胞生长抑制率分别为25.2%±1.4%、27.2%±1.0%、33.6%±2.1%、39.4%±1.8%、54.2%±2.6%，40、60 、80 μg/mL环磷酰胺联合作用后与草果挥发油组20 μg/mL草果挥发油作用后的细胞生长抑制率比较，P均lt;0.05。联合组30 μg/mL草果挥发油与10 、20 、40、60 、80 μg/mL环磷酰胺处理HepG2细胞后细胞生长抑制率分别为34.2%±2.2%、36.7%±1.8%、43.5%±1.9%、50.2%±2.2%、54.9%±2.8%，60 、80 μg/mL环磷酰胺联合作用后与草果挥发油组30 μg/mL草果挥发油作用后的细胞生长抑制率比较，P均lt;0.05。联合组40 μg/mL草果挥发油与10 、20 、40、60 、80 μg/mL环磷酰胺处理HepG2细胞后细胞生长抑制率分别为46.3%±1.6%、48.9%±1.9%、51.2%±2.2%、51.7%±1.9%、55.7%±3.0%，与草果挥发油组40 μg/mL草果挥发油作用后的细胞生长抑制率比较，P均gt;0.05。联合组与不同剂量环磷酰胺组细胞生长抑制率比较，P均lt;0.05。

2.3 不同浓度的草果挥发油与不同浓度的环磷酰胺作用于HepG2细胞的Q值 联合组10 μg/mL草果挥发油与10 、20 、40、60 、80 μg/mL环磷酰胺处理HepG2细胞后Q值分别为1.29、1.52、2.02、2.20、2.41，联合组20 μg/mL草果挥发油与10 、20 、40、60 、80 μg/mL环磷酰胺处理HepG2细胞后Q值分别为0.93、0.97、1.17、1.36、1.69，联合组30 μg/mL草果挥发油与10 、20 、40、60 、80 μg/mL环磷酰胺处理HepG2细胞后Q值分别为0.85、0.88、1.02、1.16、1.17，合组40 μg/mL草果挥发油与10 、20 、40、60 、80 μg/mL环磷酰胺处理HepG2细胞后Q值分别为1.05、1.08、1.13、1.13、1.16。

3 讨论

肝癌是一种临床常见的耐药恶性肿瘤[10]，在我国发病率居恶性肿瘤第3位，病死率居第2位[11]。目前化疗是肝癌的主要治疗手段，近年来医药学的发展使其治疗效果不断提高，但肝癌的病死率仍居高不下；而环磷酰胺是目前常用的肝癌化疗药物，但因其不良反应及耐药性，临床上用量和疗效受限，因此寻求高效低毒的药物及联用药物对降低不良反应和耐药性，提高临床疗效有重要意义。

草果挥发油是从姜科豆蔻属多年生药食同源植物草果的干燥果实中提取出的有效组分，主要由1,8-桉叶素、α-蒎烯、β-蒎烯、乙酸香叶酯等单萜、倍半萜及其氧化物组成，在抗氧化、调节胃肠功能、抗菌、抗肿瘤及改变药物通透性等方面发挥作用[1]。

本课题组前期研究已证实草果挥发油在体内外具有良好的抗肝癌活性，且毒性极低[3，4]。本实验结果显示草果挥发油和环磷酰胺联合用药比单用环磷酰胺对HepG2细胞生长的抑制作用更加明显，两者合用表现出化疗协同或相加作用，无拮抗，且两者在低浓度下便可达到理想的抗肿瘤效果，提示草果挥发油可以提高HepG2细胞对环磷酰胺的敏感性。此为草果挥发油抗肿瘤应用开发提供了更多的实验依据和途径，亦为肿瘤的临床联合治疗拓展了思路。但本研究仅局限于体外试验，其联合抑制HepG2细胞增殖的机制尚不清楚，有待进一步深入研究。

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10.3969/j.issn.1002-266X.2017.41.009

R735.7

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1002-266X(2017)41-0031-03

国家自然科学基金地区基金项目(81560574)；广西自然科学基金青年基金项目(2011GXNSFB018087, 2014GXNSFAA118235)；广西教育厅项目(201010LX341)。

杨扬(E-mail:35112908@qq.com)

2017-04-20)