活血解毒方对糖尿病大鼠视网膜组织中microRNA表达的影响

王宏亮 吕甜甜 邢玮 韩静 吴晏 张子剑 王伟

·论著·

活血解毒方对糖尿病大鼠视网膜组织中microRNA表达的影响

王宏亮 吕甜甜 邢玮 韩静 吴晏 张子剑 王伟

目的 观察活血解毒方对糖尿病大鼠视网膜组织中microRNA-125a-3p、microRNA-212-3p、microRNA-290、microRNA-129-5p、microRNA-30c-5p、microRNA-153-3p和microRNA-423-5p表达的影响，探讨其改善糖尿病视网膜病变的机制。方法 选取SPF级雄性SD大鼠15只。一次性腹腔注射链脲佐菌素诱导糖尿病模型大鼠10只，随机分为模型组和活血解毒方组，另设5只为正常对照组。造模成功后第20周开始给药，给药12周后摘取眼球，提取视网膜组织中的总RNA。采用Real-time PCR技术检测microRNA-125a-3p、microRNA-212-3p、microRNA-290、microRNA-129-5p、microRNA-30c-5p、microRNA-153-3p和microRNA-423-5p的表达。结果 与正常对照组相比，模型组microRNA-125a-3p、microRNA-212-3p、microRNA-290、microRNA-129-5p和microRNA-30c-5p表达降低(P<0.05，P<0.01，P<0.05，P<0.05，P>0.05)，microRNA-153-3p和microRNA-423-5p表达升高(P<0.01，P<0.05)；与模型组相比，活血解毒方组microRNA-125a-3p、microRNA-212-3p、microRNA-290、microRNA-129-5p和microRNA-30c-5p表达升高(P>0.05，P<0.05，P>0.05，P<0.01，P<0.05)，microRNA-153-3p和microRNA-423-5p表达降低(P<0.01，P<0.01)。 结论 推测活血解毒方是通过上调糖尿病大鼠视网膜组织中microRNA-125a-3p、microRNA-212-3p、microRNA-290、microRNA-129-5p和microRNA-30c-5p的表达，下调microRNA-153-3p和microRNA-423-5p的表达来起到延缓糖尿病视网膜病变的发生和发展进程的作用。

糖尿病视网膜病变； 活血解毒方； MicroRNA

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是目前最常见、最严重的糖尿病微血管并发症之一[1]，具有高致残率和严重危害个人生存质量的特点。在发达国家，DR是成年人致盲的首位原因[2]。DR的发病机制比较复杂，主要包括新生血管形成、血管内皮系统功能异常和细胞凋亡等，但其确切机制尚未完全阐明。MicroRNA(miRNA)是一种具有调控功能的非编码小分子RNA，长约21～24个核苷酸[3]，可通过降解或抑制靶mRNA的翻译，在转录后水平调控基因的表达[4]。近年来，越来越多的研究表明，miRNA参与调控机体内多个与DR有关的病理和生理环节。它可以促进内皮祖细胞的增殖、迁移及血管形成[5]，减少人脐静脉内皮细胞形成微血管[6]，进而促进经氧化应激处理的神经元的凋亡[7]。另外，有实验研究表明，在DR中发挥重要作用的缺氧诱导因子(hypoxia inducible factor，HIF)、内皮素-1(endothelin-1，ET-1)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等基因的表达均受到miRNA的调控[6，8]。以上研究提示，miRNA可能参与调控DR的发生和发展进程。

活血解毒方是临床经验方，主要由三七、黄连、鬼箭羽及天花粉组成，具有滋阴清热、活血通络的功效。经前期药效学实验证实，本方可保护视网膜神经细胞、改善血流动力学和抑制毛细血管内皮细胞的增生[9-11]，从而缓解DR的症状；分子生物学实验表明，本方能通过干预与DR有关的多条信号转导通路，调控相关基因的表达，从而改善DR的症状[12-13]。但是活血解毒方对miRNA的影响机制尚未探讨过，因此，本实验拟通过观察microRNA-125a-3p、microRNA-212-3p、microRNA-290、microRNA-129-5p、microRNA-30c-5p、microRNA-153-3p和microRNA-423-5p在糖尿病大鼠视网膜组织中的表达变化，阐明miRNA在DR中的作用机理，并探讨活血解毒方通过调控miRNA的表达从而了解治疗DR的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级雄性SD大鼠15只，7周龄，体质量160～190 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2012-0001。大鼠在北京中医药大学实验动物中心SPF实验室饲养，室内温度20～25℃、相对湿度50%～60%、换气次数10～15次/小时，12小时/天光照维持、昼夜循环。

1.2 药物与试剂

链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)，SigmaS0130，由北京创信生物公司分装；活血解毒方由北京中医药大学药学院提供、制备。Total RNA提取试剂盒(05060810)、Quanto-miR cDNA合成试剂盒(07060301)、Quanto-miR参照试剂盒(05102816)均购自北京旷博生物技术有限公司；Quanto-miR qPCR引物由北京旷博生物技术有限公司设计并合成；荧光定量试剂盒(10802200)，购自Roche。

1.3 实验仪器

Optium Xceed“安妥超越”血糖仪与Optium试纸，购自雅培糖尿病护理有限公司；NanoDrop 2000分光光度计，购自Thermo scientific；反转录仪，购自Bio-Rad C1000；StepOnePlus Real-time PCR仪，购自Applied Biosystems。

1.4 方法

1.4.1 造模 随机选取10只大鼠，禁食12小时，给予STZ(65 mg/kg)一次性腹腔注射，其余5只作为正常对照组，注射等量的柠檬酸钠溶液(0.1 mmol/L)。1周后尾静脉采血检测血糖，以禁食6小时血糖≥16.7 mmol/L为糖尿病模型造模成功的标准。

1.4.2 分组与给药 将10只糖尿病大鼠随机平均分为模型组和活血解毒方组，每组5只。造模成功后第20周开始给药。活血解毒方由鬼箭羽、三七、天花粉和黄连按1∶1∶1∶1的比例配比而成。鬼箭羽用60%乙醇提取后AB-8 树脂上样，然后以50%乙醇解吸附；三七以70%乙醇提取后HPD-300树脂上样，60%乙醇解吸附；天花粉与黄连混合水提、浓缩，60%乙醇醇沉静置24小时，取上清液。各提取物混匀后浓缩干燥成粉末，配成1.54 g/mL的水溶液，给予15.4 g/kg(相当于临床用药量的14倍)灌胃，1次/天；正常对照组和模型组给予等体积的纯净水灌胃，1次/天。每月检测1次血糖。32周后摘取大鼠眼球，提取视网膜组织中的总RNA。

1.5 检测指标

Real-time PCR法检测microRNA-125a-3p、microRNA-212-3p、microRNA-290、microRNA-129-5p、microRNA-30c-5p、microRNA-153-3p和microRNA-423-5p的表达。

反转录反应体系：(1)总RNA 1 μg，10×buffer 2 μL，10 μM ATP 2μL，RNA酶抑制剂0.5 μL，聚合酶1 μL，Quanto-EC3外参1 μL，加DEPC水至20 μL，将此mix离心15秒，再置于PCR仪37℃孵育1小时；(2)5×buffer 8 μL，10 mM dNTP 2 μL，RNA酶抑制剂1 μL，DEPC水8 μL，反转录酶1 μL，与第(1)步反应产物20 μL合并，共计40 μL。

反应条件：50℃反应50分钟，70℃ 15分钟终止反应。反应结束后，放-20℃冰箱保存备用。以IC1作为内参进行Real-time PCR反应。反应体系：cDNA 1 ng，2×PCR Mix 10 μL，10×UPM 2 μL，miRNA及IC1引物2 μL，加DEPC水至20 μL。反应条件：50℃预热2分钟，95℃变性10分钟，95℃退火15秒钟，50℃延伸1分钟，共40个循环。反应结束后，得到每份样品中miRNA以及IC1的CT值，以2-△△Ct计算每份样品miRNA的相对表达量。

1.6 统计学处理

2 结果

与正常对照组相比，模型组microRNA-153-3p和microRNA-423-5p表达升高(P<0.05，P<0.05)，microRNA-125a-3p、microRNA-212-3p、microRNA-290、microRNA-129-5p和microRNA-30c-5p表达降低(P<0.05，P<0.05，P<0.05，P<0.05，P>0.05)；与模型组相比，活血解毒方组microRNA-125a-3p、microRNA-212-3p、microRNA-290、microRNA-129-5p和microRNA-30c-5p表达升高(P>0.05，P>0.05，P>0.05，P<0.05，P<0.05)，microRNA-153-3p和microRNA-423-5p表达降低(P<0.05，P<0.05)。见表1～2。

表1 各组大鼠视网膜中microRNA-153-3p和microRNA-423-5p表达比较

注： 与正常组比较，aP<0.05；与模型组比较,bP<0.05。

3 讨论

研究显示，miRNA参与多种调节途径，包括发育、病毒防御、造血过程、器官形成、细胞增殖与凋亡及脂肪代谢等，能调控上百个靶基因的表达[14]，它与DR的关系已成为国内外的研究热点。近年来，一些研究表明，某些特异性的miRNA在DR的发生和发展进程中发挥不同的作用，其中microRNA-125a-3p、microRNA-212-3p、microRNA-290、microRNA-129-5p、microRNA-30c-5p、microRNA-153-3p和microRNA-423-5p的表达可能与新生血管形成或细胞凋亡的机制相关[15-22]。活血解毒方是临床经验方，全方具有滋阴清热、活血通络的功效，主要针对DR阴虚内热、络脉瘀阻之病机进行治疗。前期研究发现，本方可降低糖尿病大鼠视网膜VEGF的表达，并促进色素上皮衍生因子的表达[23]，还能够保护视网膜神经细胞、改善血流动力学和抑制毛细血管内皮细胞的增生[9-11]，对DR症状有明显的改善作用。

表2 各组大鼠视网膜中microRNA表达的比较

注： 与正常组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05。

本实验采用Real-time PCR技术检测发现：与正常对照组相比，模型组大鼠视网膜组织中microRNA-125a-3p、microRNA-212-3p、microRNA-290、microRNA-129-5p和microRNA-30c-5p表达降低，在应用了活血解毒方治疗后，上述miRNA表达均有所升高；与正常对照组相比，模型组microRNA-153-3p和microRNA-423-5p表达升高，在应用了活血解毒方治疗后，二者表达均降低。以上研究结果提示，microRNA-125a-3p、microRNA-212-3p、microRNA-290、microRNA-129-5p、microRNA-30c-5p、microRNA-153-3p和microRNA-423-5p可能通过影响DR中新生血管形成或细胞凋亡的基本病理改变，参与DR发生和发展过程，推测活血解毒方是通过调控上述miRNA的表达，进而影响细胞和血管功能，从而改善DR症状。

本实验不仅表明miRNA在DR进程中发挥重要作用，可能成为未来治疗DR的新靶点；而且证明活血解毒方可能通过调控某些miRNA的表达干预DR的发展，改善DR症状，为进一步揭示活血解毒方防治DR的分子机制奠定基础。

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(本文编辑： 韩虹娟)

Effect ofHuoxueJiedurecipe on the expressions of microRNA in the retina of diabetic rats

WANGHongliang，LVTiantian，XINGWei，etal.

CollegeofBasicMedicine，BeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing100029，China

Correspondingauthor：WANGWei，E-mail：wangwei26960@126.com

Objective To observe the effects ofHuoxueJiedurecipe(HJR)on microRNA-125a-3p,microRNA-212-3p,microRNA-290,microRNA-129-5p,microRNA-30c-5p,microRNA-153-3p and micro RNA-423-5pin diabetic rats with retina to explore the mechanism of HJR in improving diabetic retinopathy.Methods 15 SPF male SD rats wereenrolled in this study.Single intraperitoneal injection of streptozotocin (STZ) was used to induce diabetic models.The diabetic rats were randomly divided into model and HJR.The rest 5 normal rats were treated as control group.After 20 weeks,the HJR group given HJR.The rats’ retina was removed after 12 weeks of treatment,total RNA was extracted from the retina.Real-time PCR method was used to determine the expressions of microRNA-125a-3p,microRNA-212-3p,microRNA-290, microRNA-129-5p,microRNA-30c-5p,microRNA-153-3p and microRNA-423-5p.Results Compared with the control group,the expressions of microRNA-125a-3p,microRNA-212-3p,microRNA-290,microRNA-129-5p and microRNA-30c-5p in model group were decreased(P<0.05,P<0.01,P<0.05,P<0.05,P>0.05),the expressions of microRNA-153-3p and microRNA-423-5p were increased(P<0.01,P<0.05).Compared with the model group,the expressions of microRNA-125a-3p,microRNA-212-3p, microRNA-290,microRNA-129-5p and microRNA-30c-5p in HJR group increased(P>0.05,P<0.05,P>0.05,P<0.01,P<0.05),the expressions of microRNA-153-3p and microRNA-423-5p were decreased(P<0.01,P<0.01).Conclusion HJR may up-regulating the expressions of microRNA-125a-3p,microRNA-212-3p,microRNA-290,microRNA-129-5p,microRNA-30c-5pand down-regulating the expressions of microRNA-153-3p,microRNA-423-5p

Diabetic retinopathy；Huoxuejiedurecipe； MicroRNA

国家科技重大专项“重大新药创制”专项(2009ZX09103-320)

100029 北京中医药大学基础医学院[王宏亮(硕士研究生)、吕甜甜(硕士研究生)、邢玮(硕士研究生)、韩静、吴晏、张子剑、王伟]

王宏亮(1989-)，女，2014级在读硕士研究生。研究方向：中西医结合药理学研究。E-mail：17801084715@163.com

王伟(1964- )，博士，教授，博士生导师。研究方向：中西医结合药理学研究。E-mail：wangwei26960@126.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2017.03.001

2016-03-11)