糖肾宁对高糖培养的小鼠系膜细胞TGF-β1和P38MAPK表达的影响

彭麒朕 耿建国 邹大威 高彦彬 龚慕辛 吴晓明 尚雅文

·论著·

糖肾宁对高糖培养的小鼠系膜细胞TGF-β1和P38MAPK表达的影响

彭麒朕 耿建国 邹大威 高彦彬 龚慕辛 吴晓明 尚雅文

目的 观察糖肾宁对高糖培养的小鼠系膜细胞转化生长因子-1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)和P38丝裂原活化蛋白激酶(P38 mitogen activated protein kinases，P38MAPK)表达的影响。方法 以体外高糖培养的小鼠系膜细胞为研究对象，实验分为正常对照组、高糖培养组、高糖+缬沙坦组和高糖+糖肾宁高、中、低剂量组，使用大鼠含药血清给药分别处理24小时，用ELISA法检测细胞上清液中纤维连接蛋白(fibronectin，FN)的含量水平；运用Western Blot方法检测P-P38MAPK、环磷腺苷效应元件结合蛋白(cAMP-response element binding protein，CREB)、TGF-β1的蛋白水平。结果 与正常对照组比较，高糖培养组系膜细胞上清液中FN蛋白表达明显升高(P<0.05)；与高糖组比较，糖肾宁组能明显抑制P38MAPK及其下游核转录因子CREB 的水平，下调TGF-β1和FN的表达(P<0.05)。结论 糖肾宁能够抑制细胞外基质增生，可能与下调TGF-β1，抑制P38MAPK/CREB信号通路的激活，从而抑制FN等细胞外基质的合成有关。

糖肾宁； 糖尿病肾病； 转化生长因子-β1； 纤维连接蛋白

1 材料与方法

1.1 实验细胞

小鼠肾小球系膜细胞(SV40 MES 13)，中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心提供。

1.2 实验动物

8周龄SPF级雄性SD大鼠20只，体质量(250±20)g，均购自北京华阜康生物科技股份有限公司，动物合格证号：SCXK(京)2014-0004。

1.3 实验药物

糖肾宁(主要药物配比：黄芪4份、金樱子2份、川芎1份、大黄1份、葛根2份，由首都医科大学中医药学院中药制剂室制备成浸膏粉)；缬沙坦胶囊(商品名：代文，规格：80 mg/粒，批号X1448，北京诺华制药有限公司)。

1.4 主要试剂

Anti-p38 antibody [M138](abcam)，Anti-CREB antibody [E306](abcam)，Anti-p38(phospho T180+Y182) antibody [M139](abcam)，Anti-TGF beta 1 antibody(abcam)，(FN)ELISA Kit(Cusabio)，DMEM低糖(Gibco)，0.05%胰蛋白酶溶液/EDTA(Gibco)，BCA蛋白浓度测定试剂盒(北京鼎国昌盛)，胎牛血清(Hyclone)。

根据前面调查，农村户籍的订单定向医学生具有比城镇户籍的订单定向医学生更害怕失败的特点，学校应该完善其课程体系，注意做好相关思想教育工作。

1.5 主要仪器

显微摄像系统(Nikon Eclipse 80i，北京瑞驰恒业仪器科技有限公司),低温生物离心机(SIGMA，3K15，北京五洲东方科技发展有限公司)，电热恒温鼓风干燥箱(DHG-9245A型，上海一恒科学仪器有限公司)，电子天平(YP601N，上海精密科学仪器有限公司)，酶标仪(MR-96A，深圳迈瑞)，CO2细胞培养箱(HERAcell240i，赛默飞世尔)。

1.6 制备含药血清

选取SD大鼠20只，随机分为2组，含药血清组(15只)和空白对照组(5只)，大鼠给药量按人和动物体表面积折算：大鼠给药量为人体等效剂量8倍，即61.2 g/(kg·d)进行灌胃，空白对照组用生理盐水，每天灌胃1次(2.25 mL/250 g)，连续灌胃7天。末次灌胃1小时后腹主动脉取血，将采集的血液在室温中静置4小时，3000 rpm，离心15分钟，收集血清，56°C水浴30分钟进行灭活，然后过滤除菌，分装。

1.7 实验分组及药物浓度筛选

取对数期生长低糖培养的4～8代SV40 MES 13小鼠肾小球系膜细胞，消化收集，接种于96孔板培养待细胞完全贴壁，弃上清，加入不含胎牛血清的DMEM低糖培养基，同步化24小时后，吸掉培养上清，分组加入药物血清。实验分组：正常对照组(N组，用D-葡萄糖浓度为5.5 mmol/L的低糖型DMEM培养液)；高糖培养组(H组，用含30 mmol/L葡萄糖的DMEM培养液)；高糖+糖肾宁组(用含30 mmol/L葡萄糖的DMEM培养液分别加61.2 g/(kg·d)、30.6 g/(kg·d)、7.65 g/(kg·d)三个剂量10%糖肾宁含药血清，分别命名T组、MT组、LT组)；高糖+缬沙坦组(V组，30 mmol/L 葡萄糖+10 μmol/L缬沙坦)干预24小时，每组设5复孔。置于37℃，5%CO2细胞培养箱中常规培养24小时后待检。采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞上清液中FN，细胞按5×104/孔，接种于96孔板培养，分组同上，于24小时收集各组上清100 μL，按FN试剂盒说明书严格步骤操作。

1.8 Western blot法检测小鼠肾小球系膜细胞P-P38MAPK、TGF-β1、CREB的蛋白含量

SV40 MES 13小鼠肾小球系膜细胞以2.5×107/L的密度接种到60 mm培养皿中，待细胞生长至对数期时，换无血清培养24小时饥饿同步化后，吸掉培养上清，分组加入缬沙坦药物、糖肾宁含药血清，实验分组：正常对照组(N组，用D-葡萄糖浓度为5.5 mmol/L的低糖型DMEM培养液)；高糖培养组(H组，用含30 mmol/L葡萄糖的DMEM培养液)；糖肾宁组(T组，用含30 mmol/L葡萄糖的DMEM培养液+61.2 g/(kg·d) 10%糖肾宁含药血清)；缬沙坦组(V组，30 mmol/L葡萄糖+10 μmol/L缬沙坦)。干预24小时后终止培养，弃去瓶内培养基，用PBS液冲洗2次，吸干，加入细胞裂解液(RIPA和PMSF混合液)80 μL，放于冰上用细胞刮刮取3分钟，吸出培养瓶内和刮子上的液体至1.5 mL的EP管中，测定各组蛋白含量，用10%的SDS-PAGE电泳分离分离蛋白质，每孔取40 μg总蛋白含量上样，用电泳仪将蛋白质转印至PVDF膜，TBS-T洗膜三次，每次5分钟，5%的脱脂奶粉封闭1小时，用TGF-β1一抗、磷酸化P38MAPK一抗、CREB一抗，4℃孵育过夜，隔日TBS-T洗膜三次，每次5分钟，之后加入辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1小时，TBS-T洗膜三次，每次5分钟，洗膜后加化学发光剂暗室胶片曝光。

1.9 统计学处理

2 结果

2.1 糖肾宁对高糖诱导的小鼠肾小球系膜细胞上清液中FN表达的影响

与正常对照组比较，高糖组系膜细胞上清液中FN含量显著增加(P<0.05)；与高糖组比较，糖肾宁高、中剂量组上清液中FN含量均显著减少(P<0.05)，其中高剂量组FN减少最为显著，低剂量组FN含量与高糖组比较无统计学差异(P>0.05)；高、中、低剂量组FN的含量进行两两比较，均具有统计学差异(P<0.05)，表明糖肾宁对高糖诱导的小鼠肾小球系膜细胞上清液中FN表达的影响呈现剂量依赖性。故选择T组进行实验。详见表1。

表1 各组小鼠肾小球系膜细胞上清液中FN的表达情况

注： 与N组相比，aP<0.05；与H组相比，bP<0.05；与T组相比，cP<0.05；与MT组相比，dP<0.05。

2.2 糖肾宁对高糖诱导的小鼠肾小球系膜细胞中TGF-β1、P-P38MAPK、CREB蛋白水平表达的影响

与N组相比较，H组TGF-β1蛋白水平表达均明显均上调(P<0.05);与H组比较，T组、V组的TGF-β1蛋白表达均明显下调(P<0.05)。与N组相比较，H组P-P38MAPK蛋白水平表达均明显均上调(P<0.05);与H组比较，T组、V组P-P38MAPK蛋白表达均明显下调(P<0.05)。与N组相比较，H组CREB蛋白水平表达均明显均上调(P<0.05);与H组比较，T组、V组CREB蛋白表达均明显下调(P<0.05)。详见表2，图1～3。

表2 各组细胞中TGF-β1、P-P38MAPK、CREB蛋白水平表达±s)

注： 与N组比较，aP<0.05；与H组比较，bP<0.05。

图1 各组细胞中TGF-β1蛋白的表达条带

图2 各组细胞中P-P38MAPK蛋白的表达条带

图3 各组细胞中CREB蛋白的表达条带

3 讨论

糖尿病肾病是糖尿病最严重和最常见的并发症，也是临床慢性肾衰竭最主要的原发病[5]。中国是糖尿病大国，根据国际最新临床诊断标准，中国成年人群的糖尿病总体发病率约为11.6%，糖尿病前期的发病率是50.1%[6]；估计中国约有1.139亿糖尿病患者，4.934亿糖尿病前期患者，其中约有30%的1型糖尿病和20%的2型糖尿病发展为DN[7]。DN的主要病理改变为肾小球基底膜增厚、肾小球系膜细胞增殖细胞外基质积聚扩张导致肾小球硬化、纤维化[8]。其中P38MAPK通路在DN的发生、发展中发挥了重要作用，高糖环境可直接激活P38MAPK的信号转导[9]，P38MAPK与TGF-β1互为作用，TGF-β1与P38MAPK通路的激活有关[10]，P38MAPK通路的激活可以调节TGF-β1的转录与合成，从而可以引起细胞外基质积聚加重肾小球硬化和肾间质纤维化，另一方面TGF-β1也是该通路的上游因子,可以通过增强P38MAPK的活性而发挥其生物活性[11]；P38MAPK一旦被激活，可以活化CREB等转录因子[12]，从而调节目的基因的表达，导致细胞外基质FN产生增多，最终导致DN。

中医认为DN多属于“消渴”“水肿”“尿浊”“关格”等范畴，根据不同的病因病机采取相对应的辨证施治，DN多由糖尿病发展而来，因而高彦彬教授将糖尿病肾病命名为“消渴病肾病”[13]，认为DN的基本病机为本虚标实。发病初，肝肾气阴两虚，肾络瘀滞，发病中阴损及阳，脾肾虚衰，肾络瘀阻，发病晚期，肾络瘀结，因此将络病理论应用于DN的中医药防治当中，并创立中药复方糖肾宁制剂，方中黄芪益气扶正；金樱子固精缩尿；大黄逐瘀清热降浊；川芎活血化瘀通络[14]。前期临床研究证实糖肾宁对于前期及临床期肾病治疗总有效率为90.0%，在减少蛋白尿、改善肾功能方面具有重要作用[15]。糖肾宁临床随机双盲对照前瞻性研究证实该药可明显降低DN患者尿白蛋白、保护肾功能，且实验中未出现任何不良反应及毒副作用，总有效率为88.9%，明显优于洛汀新对照组[16]。

本实验结果显示高糖环境能明显促进小鼠肾小球系膜细胞中TGF-β1和P-P38MAPK蛋白表达增加、P38MAPK信号下游转录因子CREB活性增强、细胞上清液中FN的表达水平显著增加；糖肾宁能显著降低系膜细胞中TGF-β1和P-P38MAPK蛋白表达的水平，以及减弱P38MAPK信号下游转录因子CREB活性，细胞上清液中FN的表达水平显著降低，尤以高剂量组显著。推测糖肾宁抑制细胞外基质增生的作用机制可能与下调TGF-β1的表达水平，抑制P38MAPK信号通路的激活，从而抑制FN等细胞外基质的合成有关，其详细机制有待进一步深入研究。

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(本文编辑： 王馨瑶)

Effects ofTangshenningon TGF-β1 and P38MAPK signal pathway in mouse mesangial cells with high glucose condition

PengQizhen，GengJianguo，ZouDawei，etal.

SchoolofTraditionalChineseMedicine,CapitalMedicalUniversity,BeijingKeyLaboratoryofTCMCollateralDiseaseTheoryResearch,Beijing100069,China

Correspondingauthor:GengJianguo，E-mail:gengdoctor@163.com

Objective To observe the influence ofTangshenningon the expression of TGF- beta 1 and P38MAPK in murine mesangial cells cultured with high glucose. Methods Murine mesangial cells was used as the research subjects and divided into six groups: normal control group, high glucose group, high glucose administered with valsartan group, high glucose administered with high dosage ofTangshenning, high glucose administered with medium dosage ofTangshenningand high glucose administered with low dosage ofTangshenninggroup. All research subjects were administered with respective medicine according to their groups for 24 hours, then high glucose stimulated cell changes were observed, the protein level of the culture supernatant was measured by ELISA. The protein level of P38MAPK, CREB and TGF-β1 were detected by western blot. Results Compared with the normal control group, the proliferation rate of murine mesangial cells cultured in high glucose group is significantly higher (P<0.05), the expression of FN protein in the supernatant is significantly increased (P<0.05). Compared with the high glucose group, the proliferation of murine mesangial cells from all the threeTangshenninggroups were significantly depressed(P<0.05), the level of P38MAPK and its downstream transcription factor CREB were significantly decreased (P<0.05) and the expressions of TGF-β1 and FN were significantly down regulated(P<0.05). There were no significant differences in the indexes of between valsartan group and the threeTangshenninggroups. ConclusionTangshenningcould down regulate the expression of TGF-β1 and FN protein by inhibiting the P38MAPK signaling pathway, thereby inhibiting FN protein and protecting renal function.

Tangshenning； Diabetic nephropathy； Transforming growth factor-β1； Fibronectin

国家自然科学基金青年科学基金(81302951)；国家重点基础研究发展计划(973计划)(2012CB518602)

100069 北京，首都医科大学中医药学院中医临床基础学系[彭麒朕(硕士研究生)、耿建国、邹大威、高彦彬、龚慕辛、吴晓明(博士研究生)、尚雅文(硕士研究生)]

彭麒朕(1989- )，2014级在读硕士研究生。研究方向：中医药防治糖尿病。E-mail：pqzhdwj@163.com

耿建国(1956- )，博士，教授，主任医师，硕士生导师。研究方向：中医药防治糖尿病。E-mail：gengdoctor@163.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2017.03.003

2016-08-07)