正交设计试验法优选骨刺康复丸水提工艺参数

蒋龙波++张依人++张可人++陈叶童

[摘要] 目的 优选骨刺康复丸的提取工艺参数，为该制剂工业化生产提供依据。 方法 以浸膏得率与青藤碱含量为评价指标，采用流动相：乙腈-乙二胺（32∶68），流速1.0 mL/min，检测波长262 nm；柱温30℃的HPLC Welchrom C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）测定青藤碱含量，单因素试验考察药材吸水率、提取次数，正交设计试验法考察加水量、煎煮时间、浸泡时间三个因素在不同水平对实验结果的影响。 结果 骨刺康复丸最佳水提工艺参数为：药材吸水率为180.9%，提取2次 ，第一次加10倍量水，提取2.5 h，第二次加8倍量水，提取2 h。按最佳水提工艺参数验证试验结果表明，浸膏得率可达33.08%、RSD为0.64%、青藤碱含量可达16.70 mg/mL、RSD为1.99%。 结论 优选的水提工艺参数科学、合理、稳定、可行，适应于该制剂的工业化生产。

[关键词] 骨刺康复丸；浸膏得率；青藤碱含量；正交设计试验；提取工艺

[中图分类号] R284.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）02（a）-0016-05

Optimum water-extracting technology parameter of Guci Kangfu pill by orthogonal design test

JIANG Longbo1 ZHANG Yiren1 ZHANG Keren1 CHEN Yetong1 JIANG Cuiping2 ZENG Rong1 PENG Maijiao1 ZOU Long1

1.School of Pharmacy， Hu′nan University of Chinese Medicine， Hu′nan Province， Changsha 410208， China； 2.Pharmacy Department， Liuyang Chinese Medicine Hospital， Hu′nan Province， Liuyang 410300， China

[Abstract] Objective To optimize extraction technical parameters of Guci Kangfu pills， and to provide the evidence for industrial production. Methods The rate of extractum and sinomenine contents were selected as evaluation index； Sinomenine content was determined with the mobile phase of acetonitrile-ethlenediamine（32：68）， the flow rate of 1.0 mL/min，detection wavelength 262nm，and HPLC welchrom C18（250 mm×4.6 mm，5 μm） with column temperature of 30℃. The water absorption rate and the number of extraction times were investigated by the single factor experiment. The effects on the experimental results with different levels of the soaking time， the amount of water and the time of extraction was studied by orthogonal method. Results The Guci Kangfu pills optimum water extraction parameters： medicinal water absorption was 180.9%， extracting 2 times， the first with 10 times amount of water， extracting times was 2.5 h， second time with 8 times the amount of water， extracting time was 2 h. The optimum parameters of testing results showed that the extraction rate can reach 33.08%， RSD 0.64% and the content of sinomenine can reach 16.7 mg/mL， RSD 1.99%. Conclusion The optimal water extraction process parameters are scientific， reasonable， stable and feasible， and suitable for the industrial production.

[Key words] Guci Kangfu pill； The rate of extractum； Sinomenine contents； Orthogonal design test； Extraction process

骨质增生[1-2]的产生主要由于反复劳损、外伤或受风寒之邪侵袭，致机体气血运行不畅、闭住经络，引起疼痛，是人体常见的难以治愈的退行性疾病，也是临床常见的慢性疾病[3-4]。目前西医采用非激素类消炎止痛药物治疗，对缓解症状有一定效果，但皆有一定的毒副作用。而中医采用辨证论治整体观对骨质增生症[5-6]进行治疗。骨刺康复丸处方来源于湖南中醫药大学第一附属医院临床经验方（处方组成为：青风藤30 g、当归15 g、延胡索15 g、桑寄生15 g、赤芍12 g、枳壳12 g、柴胡10 g、淫羊藿10 g、甘草10 g等），多年来一直以水提制丸入药。方中青风藤[7-8]味苦、性平，具有祛风湿、通经络的功效，治疗风湿痹痛、关节肿胀为君药；臣药选以当归、延胡索、桑寄生、枳壳、等具有活血祛瘀、止痛之效的药材[9]；佐药选以赤芍、柴胡、淫羊藿等具有补肾阳、强筋骨之药材。全方具补益肝肾，养血活血祛瘀，祛风散寒止痛之功效，疗效显著，充分显示了中医药治疗本病的优势。原工艺未对工艺参数进行优化，本实验以方中浸膏得率、青藤碱（止痛活性成分）为考察指标，在单因素试验确定吸水率和提取次数的基础上，采用正交实验优选出最佳水提工艺参数，为骨刺康复丸水提工艺提供有效依据[10]。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1200高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；RE-2000B旋转蒸发仪（巩义市予华仪器有限责任公司）；SHB-ⅢA循环水式真空泵（北京中兴伟业仪器有限公司）；DZF-6020型真空干燥箱（北京中兴伟业仪器有限公司）；HH-600三用恒温水箱（金坛市神科仪器厂）；AR124CN电子天平（奥豪斯仪器上海有限公司）；万能粉碎机（长沙宏卫科技制药机械设备厂）；DZ-20小型多功能中药制丸机（长沙市岳麓区中南制药机械厂）。

1.2 试药

骨刺康复丸中药材均购于湖南中医药大学第一附属医院合格药材库，经邹龙教授鉴定均符合《中国药典》2015年版一部相关药材项下的有关规定[11]，青风藤中青藤碱含量不低于0.5%；青藤碱对照品（上海源叶生物科技有限公司，批号YY-90116，含量≥98%）；乙腈（色谱纯 美国TEDIA）；甲醇（色谱纯 美国TEDIA）；乙二胺（分析纯 长沙市有机试剂厂）等。

2 方法与结果

2.1 骨刺康复丸水提液中青藤碱的含量测定

2.1.1色谱条件 色谱柱为Welchrom C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈-乙二胺（32∶68）[12]，流速为1.0 mL/min，检测波长为262 nm；柱温为30℃。

2.1.2 对照品溶液的制备 取青藤碱对照品，精密称定，加甲醇定容至10 mL，制成每毫升含1.16 mg青藤碱对照品的浓储备液，再取青藤碱对照品浓储备液5 mL，加甲醇定容到10 mL，制成每1 mL含青藤碱0.58 mg的对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备 按正交1号制备方法取试验样品（提取液）5 mL，加甲醇定容到10 mL，混匀，离心，取上清液，以0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，待测。

2.1.4 阴性溶液的制备 取除去青藤药材外的17味药材，按正交1号制备方法制成制备液，再按2.1.3处理成分析用阴性供试品溶液。

2.1.5 专属性试验 按照2.1.1，分别精密吸取上述三种溶液各10 μL，进针测量，记录HPLC色谱图。在阴性样品的HPLC色谱图中，未见青藤碱的色谱峰出现，表明阴性样品对青藤碱的测定无干扰，结果见图1。

2.1.6 标准曲线的绘制 精密吸取青藤碱0.58 mg/mL的对照品储备液适量于2 mL容量瓶中，加甲醇稀释成浓度分别为580、290、145、58、29、14.5 μg/mL的溶液，精密吸取各浓度梯度对照品溶液各10 μL进样，以峰面积为横坐标（X），浓度为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得回归方程Y =0.1181 X+2.5978（R2 =0.9999），青藤碱在145～580 μg/mL呈良好的线性关系。

2.1.7 精密度试验 取2.1.2项下同一对照品溶液10 μL进样，按照上述色谱条件，连续重复进样6次，测定青藤碱峰面积的RSD值。结果RSD=0.13%，表明该仪器精密度良好。取正交1号提取液10 μL进样，按照上述色谱条件，连续进样6次，测定青藤碱峰面积的RSD值。结果RSD=1.87%，表明该仪器精密度良好。

2.1.8 重复性试验 取正交1号提取液6份，每份5 mL，分别加甲醇定容到10 mL，混匀，离心，取上清液，以0.45 μm微孔滤膜过滤，按色谱条件进行含量测定，进样量为10 μL，测定并计算样品中青藤碱的含量。青藤碱的平均含量为0.1939 mg/mL，RSD值为1.42%，结果表明，该方法重复性良好。

2.1.9 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液（正交1号提取液），分别于0、2、4、8、12、24 h进样10 μL，测定青藤碱的峰面积及含量。RSD值为2.34%，表明供试品在24h内的含量稳定。

2.1.10 加样回收率试验 取正交1号提取液6份，每份取3 mL，精密加入浓度为0.58 mg/mL的对照品溶液1 mL，加甲醇定容到10 mL，按供试品制备方法同法处理，0.45 μm微孔滤膜过滤，按2.1.1色谱条件测定，进样量10 μL，计算样品中青藤碱的含量及回收率。青藤碱的平均回收率为99.97%，RSD值为2.87%，结果表明，该分析方法回收率较好，准确度高，结果表明该方法可用于骨刺康复丸水提工艺研究。

2.2 骨刺康复丸水提液与干浸膏得率的测定方法

将处方1/2量青风藤，当归等水提药材，在回流提取装置上按提取方案分别提取俩次，合并提取液，将每份提取液在60℃、0.0095 MPa条件下减压浓缩至稠膏状，并减压干燥至含水量为（5±0.15%），使试验结果具有可比性。

2.3 单因素试验考察药材吸水率和提取次数

2.3.1 药材吸水率的考察 按处方量称取青风藤、当归等水提药材，共计219 g，共三份，分别加入10倍量水，浸泡24 h，滤过，测量滤液体积，并计算吸水率。结果可得药材吸水率平均值为180.9%，RSD为1.231%，根据实际操作，可确定第一次提取多加2倍量的水作为提取溶媒量。

2.3.2 提取次數的选择 因提取次数为非连续变量，不能列入正交表中考察，因此必须采用单因素试验，且根据前期对处方药材吸水率的研究，按1/2处方量称取青风藤、当归等水提药材，总量109.5 g，共三份，第一份加热回流提取1次，加水量10倍，提取时间2.5 h；第二份提取2次，分别加水量10倍、8倍，提取时间分别为2.5 h、2 h，合并2次提取液；第三份提取三次提取，分别加水量10倍，8倍，8倍，提取时间分别为2.5 h、2 h、2 h，合并3次提取液；分别得到1、2、3次提取液，再分别在60℃、0.0095 MPa条件下减压浓缩定容至500 mL，上述方法重复2次，同2.2法测定浸膏得率和提取液中青藤碱的含量。见表1。

2.3.3 正交设计试验与结果 通过查阅文献及前期实验[13-16]，，按1/2处方量称取药材，结合单因素试验结果，选取了加水量（A），煎煮时间（B），浸泡时间（C）三个考察因素，并以浸膏得率和青藤碱含量为考察指标，每个指标分别占40%、60%来进行综合评分，总分作为优化指标，进行方差分析。按正交设计L9（34）表安排九次试验，见表2，结果见表3、4。

由表4因素间方差分析结果可知，A（P=0.0303）因素、B因素（P=0.0124）有统计学意义，再进行水平间方差分析，见表5。

由表5正交设计试验水平间方差分析可知，A因素在各水平间1与2、1与3间有统计学意义，按K值大小顺序选择2或3水平，根据经济学原则，选择2水平；B因素在各水平间1与3、2与3间有统计学意义，按K值大小排序选择3水平；C因素水平间皆无统计意义，从经济学角度选择不浸泡为佳，因此水提取的最佳工艺为A2B3C1，即药材不浸泡，提取2次，加水量为药材量的10倍、8倍，煎煮时间2.5 h、2.0 h，该工艺参数可为工业化生产提供依据。

2.3.4 验证试验 对正交试验设计优选出的最佳提取工艺条件平行进行三次验证试验，按1/2处方量称取青风藤，当归等水提中药，提取2次，第一次加10倍量水，提取2.5 h，第二次加8倍量水，提取2 h，滤过，合并滤液，定容到500 mL，分别按“提取次数的选择试验”项下方法测定浸膏得率和青藤碱含量。结果见表6。

结果表明：按最佳提取工艺方案所得浸膏得率和青藤碱含量波动不大，浸膏得率可达33.08%、RSD为0.64%、青藤碱含量可达16.70 mg/mL、RSD为1.99%，综合评分均值为23.25，RSD为1.05%，可见所确定的提取工艺条件稳定、可重复。

3 讨论

骨刺康复丸是在临床经验方基础上将汤剂改变剂型制成水丸，水丸具有溶散、释药快，起效快，迅速缓解骨质增生引起的剧烈疼痛，可减少不良反应。该方中青风藤为君药，具有祛风湿、通经络，治疗风湿痹痛、关节肿胀之功效，其主要有效成分为青藤碱，故选择青藤碱为考察指标。

本研究首创骨刺康复丸的最佳提取工艺参数，为其工业化生产、质量控制研究、稳定性研究、药效、毒理学和临床研究提供了依据。

骨刺康复丸系大复方，应有两种有效成分含量测定指标，很遗憾本实验只做了青藤碱一种指标。原计划建立延胡索乙素含量测定指标，因水提液中，延胡索乙素含量很低，HPLC检测不到，故放弃。从理论上讲，延胡索应采用50%乙醇提取，但本方由汤剂改成丸剂，沿用已久，只能采用水提，若采用乙醇提取，处方剂量与提取方法均相应改变，系今后考虑的问题[17]。

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（收稿日期：2016-12-09 本文编辑：占汇娟）