混合感染因素对难治性肺炎支原体肺炎的影响

陆燕红张新星严永东顾文婧陈正荣朱灿红王宇清黄 莉邵雪君季 伟

苏州大学附属儿童医院 1.呼吸科，2.检验科（江苏苏州 215003）

·论 著·

混合感染因素对难治性肺炎支原体肺炎的影响

陆燕红1张新星1严永东1顾文婧1陈正荣1朱灿红1王宇清1黄 莉1邵雪君2季 伟1

苏州大学附属儿童医院 1.呼吸科，2.检验科（江苏苏州 215003）

目的了解混合感染因素对难治性肺炎支原体肺炎（RMPP）的作用及影响。方法收集并分析2013年1月至2015年12月286例RMPP患儿的病史资料。依据病原检测结果将患儿分为RMPP混合感染组和单纯感染组，比较两组患儿临床特征及实验室检查结果。结果混合感染组患儿热程和住院天数分别为12.（511.0～14.0）d、12.0（09.0～14.0）d，均明显高于单纯感染组的11.0（9.0～13.0）d、10.0（8.0～12.0）d，差异均有统计学意义（P均＜0.01）。混合感染组患儿白细胞计数，中性粒细胞百分比，血小板计数，乳酸脱氢酶、C反应蛋白（CRP）＞40 mg/L、CRP＞100 mg/L及CK-MB升高发生率均高于单纯感染组，差异有统计学意义（P均＜0.05）。混合感染组气胸、呼吸衰竭发生率高于单纯感染组，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。混合感染组血液系统损害、心肌损害、电解质紊乱发生率高于单纯感染组，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。结论混合感染会使RMPP患儿发热时间延长，全身炎症反应加重，肺内外并发症发生率升高，并增加患儿的住院时间。

难治性肺炎支原体肺炎； 混合感染； 儿童

肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae，MP）已成为5岁以上儿童常年社区获得性肺炎的重要病原之一，儿童肺炎支原体肺炎（Mycoplasma pneumoniae pneumonia，MPP）发病率占社区获得性肺炎的10%～30%，有研究报道2007年MPP的发生率已是1999年的10倍[1]。近年来发现，一些MPP患儿即使应用大环内酯类抗生素进行治疗，仍高热难退，病变加重，或合并肺外系统损害，临床治疗难度增加且容易导致肺部后遗症，如闭塞性细支气管炎、坏死性肺炎等[2,3]，称为难治性肺炎支原体肺炎（refractory Mycoplasma pneumoniae pneumonia，RMPP）。RMPP的发病机制可能涉及多方面，如过度免疫反应、混合感染、病原体耐药、菌体载量以及个体免疫反应等[4,5]。本研究对6 340例呼吸道感染患儿进行RMPP临床及实验室检查结果分析，了解混合感染在儿童RMPP发病机制中的作用，为RMPP的科学防控及治疗提供依据。

1 对象和方法

1.1 研究对象

收集2013年1月至2015年12月因呼吸道感染入住苏州大学附属儿童医院呼吸科的6 340例患儿临床资料，其中MPP患儿2 318例，RMPP患儿286例，年龄2个月～15岁。RMPP诊断标准：①年龄1个月～15岁；②符合肺炎诊断，有呼吸道症状伴或不伴发热，X线提示肺部有实质性浸润[6]；③符合MP感染标准，血清MP抗体阳性或痰MP DNA阳性；④符合难治性肺炎标准，在当地及本院应用大环内酯类抗生素治疗7 d或以上，仍持续发热、临床症状加重、肺部影像学表现加重[7]。

RMPP患儿依据病原检测结果分为单纯感染组（仅有MP感染）和混合感染组（除MP感染外，还检出1种或以上其他病原感染）。

1.2 方法

1.2.1 临床资料 收集入组患儿的临床资料，包括年龄、性别、发热热程、临床症状、临床诊断、实验室检查结果、影像学检查结果等。

1.2.2 标本采集 入院24 h内用一次性吸痰管插入患儿鼻腔7～8 cm，利用负压吸取痰液 1～2 mL送检。入院24 h内及治疗7～10 d病情好转时采集静脉血1～2 mL，30 min内送检。

1.2.3 痰MP DNA检测 采用实时荧光定量PCR法。取新鲜痰液标本，经震荡、离心、去上清，加入裂解液提取DNA，进行PCR扩增。探针结合序列位于上游引物与下游引物之间。在特异性杂交荧光探针的5’端结合荧光发光基团，在3’端结合荧光吸收基团。将样品（标本和质控品）上清液2 µL直接加入阳性定量参考品于反应管中，12 000 r/min，离心半径9.5 cm，离心300 s，离心后放入仪器样品槽。循环温度设置：93℃ 2 min→93℃ 45 s→55℃ 60 s，10个循环；93℃30 s→55℃ 45 s，30个循环。荧光采集点设置55℃ 45 s。荧光定量PCR的结果以Ct值显示，反应结束电脑自动分析结果。结果判定：①Ct值≥39，为阴性；②Ct值＜38，阳性；③Ct值38～39进行重复测定。试剂盒购自广州中山大学达安基因股份有限公司，仪器为美国BIO-RAD公司的Icycleriq荧光定量PCR仪。

1.2.4 血清MP特异性抗体检测 采用半定量法检测。取患儿外周血1～2 mL，常规离心，取血清10 µL，用样本缓冲液1:100稀释，充分混匀后加入抗原包被的微孔板上的微量孔中，将标准血清和对照血清各100 µL加入微量孔中。室温（18℃～25℃）下温育30 min，缓冲液洗涤3遍后加入100 µL过氧化物酶标记的抗人IgM（羊）抗体。室温温育30 min，倒掉微孔板内液体，洗涤3遍后，滴加100 µL色原/底物液至每一微孔，避光温育15 min。以与加色原/底物液相同的速度和顺序滴加100 µL终止液至每一微孔。终止后于酶标仪450 nm波长处测光密度值（D值）。计算样本D值和标准品D值的比值，通过比值半定量判断MP-IgM结果。比值＞1.1为阳性，0.8～1.1为可疑，＜0.8为阴性。对出院时复查的血清MP-IgM较入院时第一次检测值增高≥1.5倍诊断为MP急性感染[8]。试剂盒购自德国欧蒙医学实验诊断股份有限公司。

1.2.5 其他病原检测 ①采用直接免疫荧光法检测呼吸道7种常见病毒，即呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV），腺病毒（adenovirus，ADV），流感病毒A、B型（influenza virus type A and B，IV-A和IV-B），副流感病毒l、2、3型（parainfluenza virus type 1～3，PIV l～3）。检测试剂为D3 UltraTM Respiratory Virus Screaning & LD KIT（DIAGNOSTIC HYBRIDS，USA），操作步骤及结果判断按说明书进行。荧光显微镜购自德国莱卡公司。②采用荧光定量PCR法检测肺炎衣原体（Chlamydia pneumoniae，CP）、博卡病毒（human bocavirus，HBoV），RT-PCR法检测鼻病毒（human rhinovirus，HRV）、人偏肺病毒（human metapneumovirus，hMPV）。检测试剂采用中山大学达安基因有限公司的核酸扩增荧光试剂盒，操作步骤严格按照试剂盒要求进行，HRV、hMPV以阳性或阴性表示，HBoV、MP及CP记录DNA的基因拷贝数量。③细菌培养，取10 μL痰标本制成悬液，取悬液分别接种于哥伦比亚选择性培养基（血平板、巧克力平板各1块），置5% CO2培养箱（35℃，18～24 h）培养，根据培养基菌落特点、革兰染色、显微镜下观察及生化反应等方法鉴定细菌，人工计数菌落＞1.0×103cfu/ mL为阳性。哥伦比亚琼脂为英国 Oxoid 公司产品。具体操作及结果判定按标本的细菌学检验程序进行。

1.3 统计学分析

数据分析采用SPSS 18.0软件包，计数资料以百分比或率表示，各组阳性率比较采用χ2、校正χ2或Fisher精确概率法检验。非正态分布计量资料以中位数（四分位数间距）表示，两组间比较采用Wilcoxon秩和检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

2013年1月—2015年12月间6 340例住院患儿中MPP 2 318例（36.56%），符合RMPP诊断者286例，其中混合感染组68例（23.78%），单纯感染组218例（76.22%）。混合感染组患儿中位年龄为5.70（3.85～7.33）岁，其中男36例、女32例；单纯感染组平均年龄为5.98（3.67～8.17）岁，其中男112例、女106例，两组患儿性别（χ2=0.05，P=0.822），年龄（Z=0.85，P=0.395）差异无统计学意义。

2.2 RMPP患儿混合感染情况

混合感染组68例患儿中，混合RSV感染5例，混合ADV感染2例，混合IV-A感染 3例，混合PIV3感染3例，混合HBoV感染13例，混合HRV感染6例，混合肺炎链球菌感染39例，混合流感嗜血杆菌感染5例，混合金黄色葡萄球菌感染2例，混合卡他莫拉菌感染1例，混合大肠埃希菌感染1例，未见IV-B、PIV1、PIV2、hMPV、CP等混合感染。混合感染中以肺炎链球菌感染最常见，高达57.35%，其次为HBoV。

2.3 两组临床及实验室特征比较

RMPP混合感染组患儿热程和住院天数分别为12.5（11.0～14.0）d、12.0（9.0～14.0）d，均明显高于单纯感染组的11.0（9.0～13.0）d、10.0（8.0～12.0）d，差异有统计学意义（P均＜0.001）。混合感染组患儿白细胞计数（WBC）、中性白细胞百分比（N%）、血小板计数（PLT）、乳酸脱氢酶 （LDH）均高于单纯感染组，差异有统计学意义（P均＜0.05）。混合感染组患儿C反应蛋白（CRP）升高（＞8 mg/L）发生率与单纯感染组的差异无统计学意义（P＞0.05），但CRP＞40mg/L、CRP＞100mg/L发生率均高于单纯感染组，差异有统计学意义（P均＜0.05）。混合感染组患儿心型肌酸激酶（CK-MB）升高发生率高于单纯感染组，差异有统计学意义（P＜0.05），而两组丙氨酸氨基转移酶（ALT）升高发生率差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 混合感染组和单纯感染组临床特征及实验室检查比较

2.4 混合感染与单纯感染组肺内症状比较

RMPP混合感染组患儿大叶性肺炎、胸腔积液、肺不张发生率与单纯感染组相比，差异无统计学意义（P均＞0.05）。RMPP混合感染组患儿气胸及呼吸衰竭发生率均高于单纯感染组，差异有统计学意义（P均＜0.05）。见表2。

2.5 混合感染与单纯感染组肺外并发症比较

RMPP混合感染组患儿肺外并发症总体发生率明显高于单纯感染组，差异有统计学意义（P=0.006）。RMPP混合感染组患儿血液系统损害（包括白细胞、血红蛋白、血小板减低等）、心肌损害（CK-MB升高）、电解质紊乱（低钾血症、低钠血症等）均高于单纯感染组，差异有统计学意义（P均＜0.05），两组消化系统损害（ALT升高、肝脾肿大等）及皮肤、关节损害（皮疹、关节肿痛等）的发生率差异无统计学意义（P均＞0.05）。见表3。

表2 混合感染组和单纯感染组肺内症状比较 [n(%)]

表3 混合感染组和单纯感染组肺外并发症比较 [n(%)]

3 讨论

MP主要以气溶胶形式通过飞沫传播，一年四季均可发病，夏秋季节高发，每2～3年有一个流行高峰，流行期可持续2年左右[9,10]。传统观念认为，MP感染主要引起上呼吸道感染、肺炎，仅有少数可引起严重的肺外并发症，如肾炎、免疫性溶血性贫血等，且MP感染具有一定的自限性，即使不治疗，多数患儿会逐渐自愈。但近年来，临床上MP感染后短时间内出现肺部大片炎症、中到大量胸腔积液、气胸等的RMPP病例较前明显增加，其病情进展迅速，疾病后期出现胸膜增厚，甚至可导致永久的肺部后遗症，如支气管扩张、单侧透明肺、急性呼吸窘迫综合征、闭塞性细支气管炎、坏死性肺炎、肺纤维化等[3-5]，临床治疗困难，病程迁延。虽然有关RMPP发病机制的研究报道较多，但其具体发病机制目前尚不清楚。有学者认为RMPP发病主要与患儿对大环内酯类抗生素耐药、混合感染以及免疫炎症反应等有关[1]。也有研究者认为MP感染后患儿病情的轻重可能与MP感染的菌体载量、个体的免疫炎症反应等有关[11,12]。有研究认为混合感染可以加重MPP患儿病情，也有MPP混合感染致患儿死亡的报道[13]。本研究显示，RMPP混合感染中以混合肺炎链球菌感染最为常见，高达57.35%，其次为HBoV，其余可见RSV、ADV、IV-A、PIV3、HRV、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌等。

国内有研究认为，MPP存在混合感染的患儿发热时间明显长于非混合感染患儿，且住院时间更长[12]。CRP可作为判断MPP炎症反应轻重较为灵敏的指标。相关研究显示，RMPP的临床特征包括发热持续10 d以上、CRP＞40 mg/L、肺部高密度均匀一致实变阴影（超过2/3肺叶，CT值＞40 HU，伴或不伴有胸腔积液）等[14]。PLT及LDH水平在RMPP患儿中均有所升高[15]。也有学者发现RMPP患儿血清中IL-18含量与病情严重程度密切相关，而血清中LDH含量又与IL-18水平呈正相关，因此血清LDH水平可判断RMPP的严重程度[16]。本研究显示，存在混合感染的RMPP患儿发热时间长于单纯感染患儿，其白细胞计数、中性粒细胞百分比、血小板、LDH均高于单纯感染患儿。虽然混合感染患儿CRP升高（＞8 mg/L）发生率与单纯感染患儿的差异不明显，但其CRP＞40 mg/L、CRP＞100 mg/L发生率均高于单纯感染的患儿，且RMPP混合感染患儿住院时间明显长于单纯MP感染患儿。

有研究认为RMPP患儿胸部影像学表现为大叶性肺炎、胸腔积液的发生率均较普通MPP患儿高[5]。一项多因素logistic回归分析研究显示，肺部影像学表现为大片实变影、CRP升高明显对早期RMPP的诊断具有一定的临床指导价值[17]。国内学者报道RMPP伴有混合感染的患儿肺不张及肺实变发生率与非混合感染患儿无明显差别，但胸腔积液发生率更高[12]。而本研究显示RMPP混合感染的患儿大叶性肺炎、胸腔积液及肺不张的发生与单纯MP感染患儿并无明显差别，但混合感染的患儿气胸及呼吸衰竭的发生率更高，需引起重视。

多项研究表明，RMPP可累及多个肺外器官，发生多种肺外并发症，如心肌炎、肾炎、脑炎、癫痫、免疫性溶血性贫血、Stevens-Johnson综合征等[2,3,17,18]。有研究报道混合其他病原感染后可进一步加重MP肺外并发症的发生[18]。本研究发现RMPP混合感染患儿更容易发生血液系统损害、心肌损害、皮肤及关节损害、电解质紊乱等方面的并发症，但混合感染并没有增加消化系统并发症的发生率，这与本课题组前期研究结论一致[5]。

综上所述，混合感染会使RMPP患儿发热时间延长，全身炎症加重，使肺内外并发症发生率升高，并增加患儿的住院时间。通过本研究，初步了解混合感染在RMPP患儿发病中的作用及影响，为临床医师合理治疗RMPP提供参考依据。

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Role and in fl uence of coinfection factor to refractory Mycoplasma pneumoniae pneumonia in children

LU Yanhong，ZHANG Xinxing，YAN Yongdong，GU Wenjing，CHEN Zhengrong，ZHU Canhong，WANG Yuqing， HUANG Li， SHAO Xuejun，JI Wei (1.Department of Respiratory Disease, 2.Department of Clinical Laboratory， Children's Hospital of Soochow University, Suzhou 215003, Jiangsu, China)

ObjectiveTo study the role and in fl uence of coinfection factor to refractory Mycoplasma pneumoniae （MP）pneumonia (RMPP) in children.MethodsClinical data and sputum specimen of 286 hospitalized children of RMPP were collected from January, 2013 to December, 2015.According to the results of pathogen detection, children were divided into RMPP coinfection group and simple MP infection group.Clinical features and laboratory tests were compared between the two groups.ResultsThe durations of fever and hospitalization of the RMPP coinfection group were 12.5（11.0-14.0）days and 12.0（9.0-14.0）days, respectively, which were significantly longer than those of simple MP infection group, 11.0（9.0-13.0）days and 10.0（8.0-12.0）days (Z=3.947, P＜0.001, Z=3.519, P＜0.001).In the RMPP coinfection group, white blood cell count, the percentage of neutral granulocytes, pleteltes count, lactate dehydrogenase and the incidence of C-reaction protein (CRP) greater than 40 mg/L, and CRP greater than 100 mg/L, elevated CK-MB of were higher than those of simple MP infection group (all P＜0.05), but the incidence of CRP greater than 8 mg/L and elevated ALT in the two groups showed no signi fi cant difference (both P＞0.05).The incidence of pneumothorax and respiratory failure in children of RMPP coinfection group were higher than those in the simple MP infection group (χ2=5.873, P=0.015, χ2=11.995, P=0.001), but the incidence of lobar pneumonia, pleural effusion, atelectasis in the two groups had no signi fi cant difference (all P＞0.05).The incidence of blood system damage, myocardial damage, skin and joint damage and electrolyte disorders in RMPP coinfection group were higher than those of simple MP infection group (all P＜0.05).ConclusionsChildren with RMPP coinfection tend to be with prolonged duration of fever, increased systemic inflammation, higher incidence of pulmonary and extrapulmonary complications, and longer duration of hospitalization.

refractory Mycoplasma pneumoniae pneumonia; coinfection; child

10.3969/j.issn.1000-3606.2017.02.001

2016-08-15)

(本文编辑：蔡虹蔚)

苏州市“科教兴卫”青年科技项目（No.KJXW2016019）；国家自然科学基金项目（No.81570016）；国家青年自然科学基金项目 （No.81401296）

季伟 电子信箱:szdxjiwei@163.com