动态显色基质法测定地佐辛注射液中细菌内毒素的含量

石晶萍，黄加秀

（扬子江药业集团有限公司，江苏 泰州 225321）

动态显色基质法测定地佐辛注射液中细菌内毒素的含量

石晶萍，黄加秀

（扬子江药业集团有限公司，江苏 泰州 225321）

目的：采用动态显色基质法测定地佐辛注射液中的细菌内毒素含量。方法：根据《中华人民共和国药典》（2015年版）四部通则1143细菌内毒素检查法，对样品进行干扰预实验和干扰实验，确定样品的最小不干扰浓度。结果：地佐辛注射液可采用稀释200倍的溶液进行定量检测。结论：动态显色基质法可用于检测地佐辛注射液中的细菌内毒素含量。

地佐辛注射液；动态显色基质法；细菌内毒素；含量测定

地佐辛注射液为我公司生产的阿片类受体激动-拮抗剂，属于苯吗啡烷类衍生物，它是一种起效迅速、能缓解术后疼痛的强效镇痛药物，其镇痛强度和持续时间同吗啡的效果相当，但其成瘾性小[1-3]，在临床中被广泛应用。为了保证其质量，避免临床使用过程中热原反应的发生，需严格控制样品中的细菌内毒素含量，细菌内毒素检查法是检测供试品中细菌内毒素限量的方法，主要分为凝胶法和光度测定法，后者包含浊度法和显色基质法[4-5]，本文采用动态显色基质法对地佐辛注射液细菌内毒素含量检测进行定量研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品地佐辛注射液，规格1 mL：5 mg（批号：14060541、14060641、14060941）以上样品均由扬子江药业集团有限公司生产。

1.1.2 试剂细菌内毒素工作标准品（WSE），效价80 EU/支（批号：150601-201681），由中国食品药品检定研究院提供。细菌内毒素检查用水（BET水），50 mL/瓶（批号：1603310），由湛江安度斯生物有限公司提供。鲎试剂，规格50-0.005EU/mL，装量1.25 mL/支（批号：1412110），由湛江安度斯生物有限公司提供。

1.1.3 仪器LKL064-03型动态试管仪（湛江安度斯生物有限公司），检测波长405 nm；ZH-2型自动漩涡混合器（天津药典标准仪器厂）；FED400烘箱（宾德）。

1.1.4 材料光度法检测用反应管（规格：8×75 mm），由湛江安度斯生物有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 细菌内毒素限值的确定细菌内毒素限值L ＝K/M，本品为注射剂、说明书规定的临床最大剂量为20 mg，其K＝5 EU/（kg·h），则M＝20 mg/60（kg·h）；根据公式计算限值L＝K/M＝15 EU/mg，企业出于安全考虑为了更严格控制细菌内毒素，故将地佐辛注射液限值L定为7.5 EU/mg[6]。

1.2.2 鲎试剂灵敏度复核按《中华人民共和国药典》（2015年版）四部附录细菌内毒素检查法[7]鲎试剂灵敏度复核试验项下规定进行，结果均符合规定。

1.2.3 标准曲线的可靠性试验取BET水，将细菌内毒素工作标准品进行溶解稀释，最终得到细菌内毒素标准品浓度分别为5.0，0.5，0.05，0.005 EU/mL的标准品溶液，每稀释一步均应在漩涡混合器上混匀30 s。各取0.1 mL分别加到预先加有0.1 mL鲎试剂的反应管内，混合均匀，立即插入LKL064-03型动态试管仪中。温度为（37±1）℃，每一个浓度重复3管，并以BET水作空白对照。见表1。

表1 标准曲线的可靠性试验结果

将数据进行线形回归分析，得回归性方程：

平行管的CV均＜10%，空白对照在规定检测时间外，相关系数∣r∣＝0.999 1＞0.980，故标准曲线可靠。

1.2.4 最小有效稀释浓度（C）的确定供试品的C计算方式如下：

式中L为细菌内毒素限值7.5 EU/mg，λ为标准曲线细菌内毒素最低浓度0.005 EU/mL。则得出供试品的C为0.000 667 mg/mL（供试液初始浓度5 mg/mL即最大可稀释7 500倍）。

1.2.5 干扰试验初筛实验取供试品一瓶，用BET水分别稀至0.1，0.05，0.025，0.012 5 mg/mL（分别稀释50，100，200，400倍）作为供试品溶液。同时进行同样稀释倍数的稀释，其中添加中点浓度即0.5 EU/mL的细菌内毒素对照品溶液作为供试品阳性对照液。

取上述制备的各溶液0.1 mL至含0.1 mL鲎试剂（50-0.005 EU/mL，用BET水复溶混合）的光度法检测用试管中，每个浓度重复2管。进行自动检测。同时以BET水作为阴性对照。见表2。

标准曲线：

变异系数在10%以下，相关系数∣r∣＝0.999 1＞0.980；空白对照在规定检测时间外；为了今后在日常检测中回收率能维持一个较好的水平，初步选择稀释倍数为200倍、回收率在100%左右的供试液做正式干扰试验。

表2 干扰试验初筛实验结果

1.2.6 干扰试验取三批供试品（批号：14060541，14060641，14060941），分别稀释至200倍作为供试品溶液（即浓度为0.025 mg/mL）。见表3。

标准曲线：

LgTg＝2.682 5－0.278 2 LgC，

CV均在10%以下，相关系数∣r∣＝0.998 7＞0.980，空白对照在规定检测时间外；回收率为50%～200%，说明供试品在稀释至200倍（即浓度为0.025 mg/mL时）下，对鲎试剂与内毒素的反应无干扰。

1.2.7 样品检验结果分别采用上述凝胶法和动态显色基质法对三批样品进行细菌内毒素含量测定。见表4。

表3 三个不同批次样品的干扰试验结果

表4 三批样品检测结果

上述表格中三批样品光度法结果：供试品原液内毒素含量＜0.100 0 EU/mL，原液规格为1 mL∶5 mg，则转换为＜0.2 EU/mg，均符合标准规定。说明该方法可用于日常监测。

2 讨论

细菌内毒素检查法是用鲎试剂与细菌内毒素产生凝聚反应的机制，以判断供试品中细菌内毒素是否符合规定的一种方法。该法与热原法比较具有灵敏度高、重现性好、标准化实验过程短，且可完成多批次供试品检测等优点[8]。动态显色基质法可以测出产品中细菌内毒素含量[9]，可以更真实更客观反应药品的内在质量。因此可以采用动态显色基质法，监控产品中细菌内毒素的具体含量，确保地佐辛注射液制剂的细菌内毒素水平在安全范围内。

[1] 刑刚.地佐辛治疗输尿管结石性肾绞痛的效果分析[J].临床医学研究与实践,2016,1(15):31-32.

[2] 潘英丽.用地佐辛和曲马多对剖宫产术中出现寒战症状的产妇进行治疗的效果对比[J].当代医药论丛,2016,14(17):33-34.

[3] 郭凤林,柴小青.右美托咪定地佐辛单独或联合用药对腔镜下胃癌根治患者术后苏醒期的影响[J].安徽医学,2016,37(9):1075-1078.

[4] 彭燕,张玲莉,王宗春.显色基质法检测乳酸左氧氟沙星氯化钠注射液细菌内毒素含量[J].中国药师,2013,16(10):1597-1599.

[5] 曾云胜,张玲莉,彭燕.显色基质法检测乳酸环丙沙星氯化钠注射液的细菌内毒素[J].中国医药导报,2015,12(18):92-95.

[6] 朱佳丽,段鹏,曹慧,等.动态浊度法定量测定碘克沙醇中细菌内毒素的含量[J].中国药师,2016,19(2):384-387.

[7] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(2015年版)四部[S].北京:中国医药科技出版社,2015:154-157.

[8] 王璐,张红宇. 刘勤凝胶法和光度法测定灯盏花素注射液中细菌内毒素的含量[J].昆明医学院学报,2010,31(2):39-43.

[9] 马平,马国荣,吴菊寿,等.凝胶法和动态浊度法在b型流感嗜血杆菌结合疫苗细菌内毒素控制中的应用比较[J].中国医药指南,2013,11(34):17-19.

本文编辑：苏日力嘎

Determination of Bacterial Endotoxin Content in Dezocine Injection by Kinetic Chromogenic Substrate Method

Shi Jing-ping, Huang Jia-xiu
（Yangtze River Pharmaceutical Group Co., Ltd., Jiansu Taizhou 225321, China）

Objective：To determine the bacterial endotoxin content in dezocine injection by dynamic chromogenic substrate method.Methods：According to the requirements in Bacterial Endotoxin Test in the Chinese Pharmacopoeia (Volume Ⅳ, 2015 edition), pre-interference and interference tests were perforemd to determine the minimum sample concentration without interference.Results：Dezocine injection may be quantitatively determined after being diluted 200 folds.Conclusion：Dynamic chromogenic substrate method may be used for the determination of bacterial endotoxin content in dezocine injection.

Dezocine Injection; Kinetic Chromogenic Substrate Method; Bacterial Endotoxin; Content Determination

R927.12

A

10.3969/j.issn.2096-3327.2017.02.008

2016 - 09 - 25

石晶萍，女，副主任药师。研究方向：药品检验与质量管理。通讯作者E-mail：sjp@yangzijiang.com