亚硒酸钠调控AMPK/mTOR信号通路对结直肠癌细胞增殖凋亡的影响及机制

廖漓漓 何少忠 涂江江 齐广莹 陈 莹 张剑波

(桂林医学院附属医院肿瘤内科，广西 桂林 541001)

亚硒酸钠调控AMPK/mTOR信号通路对结直肠癌细胞增殖凋亡的影响及机制

廖漓漓 何少忠 涂江江 齐广莹 陈 莹1张剑波2

(桂林医学院附属医院肿瘤内科，广西 桂林 541001)

目的 探讨亚硒酸钠调控AMPK/mTOR信号通路对结直肠癌细胞增殖凋亡的影响及机制。方法 培养人结直肠癌细胞株HT-29、SW620和 HCT116，用1.25、2.5、5、10、20 μmol/L的亚硒酸钠处理细胞48 h，CCK8试验检测不同浓度亚硒酸钠对细胞增殖的影响；10、20 μmol/L的亚硒酸钠作用于人结直肠癌细胞株HT-29 12、24、48、72 h后，CCK8试验检测亚硒酸钠作用不同时间对细胞增殖的影响；10、20 μmol/L的亚硒酸钠作用于人结直肠癌细胞株HT-29 48 h，流式细胞仪检测细胞凋亡率并用Western印迹检测蛋白表达。结果 随着亚硒酸钠浓度的增加，人结直肠癌细胞株HT-29、SW620和HCT116的抑制率增大，具有浓度依赖性，亚硒酸钠对人结直肠癌细胞株HT-29、SW620和HCT116的IC50分别为(5.060±1.01)、(6.701±1.21)、(7.471±1.47)μmol/L，后期选择人结直肠癌细胞株HT-29为研究对象；10和20 μmol/L的亚硒酸钠对细胞的抑制率在各个时间点都显著高于0 h抑制率(P<0.01)，且随着时间的延长抑制率增加；10、20 μmol/L的亚硒酸钠处理后细胞的凋亡率均显著高于0 μmol/L，具有浓度依赖性(P<0.01)，细胞中p-AMPK和Bax的蛋白表达显著高于0 μmol/L组，p-mTOR和Bcl-2的蛋白表达显著低于0 μmol/L组且具有浓度依赖性(P<0.01)。结论 亚硒酸钠能抑制人结直肠癌细胞株HT-29的增殖，促进细胞的凋亡，使Bcl-2蛋白表达下降，Bax蛋白表达上升，可能与AMPK/mTOR信号通路调控有关。

亚硒酸钠；结直肠癌；AMPK/mTOR；增殖；凋亡

我国结直肠癌的发病率呈上升趋势〔1,2〕。目前治疗主要采取手术切除和放化疗辅助，但都有一定的局限性〔3〕。硒是人体必需的微量元素，对人体的健康具有重要影响〔4〕。硒的生物学特性非常广泛，可诱导肺癌、胃癌、前列腺癌等多种肿瘤细胞的凋亡〔5～7〕。亚硒酸钠是研究最早的一种无机硒化合物，同样能诱导肿瘤细胞的凋亡〔8〕，但亚硒酸钠对结直肠癌细胞的影响及机制的研究较少，本文旨在探讨硒酸钠对结直肠癌细胞增殖凋亡的影响及机制。

1 材料与方法

1.1 材料 细胞：人结直肠癌细胞株HT-29、SW620和 HCT116购自中国科学院细胞库。主要试剂和仪器：兔抗鼠Bcl-2、Bax多克隆抗体均购自北京博奥森生物技术有限公司；p-AMPK和 p-mTOR抗体购自Cell Signaling Technology 公司；青链霉素购自华北制药厂；RPMI1640培养基购自Hyclone公司；胎牛血清购自美国Gibco公司；AnnexinV-FITC/PI试剂盒购自Invitrogen公司；CCK8细胞增殖试剂盒购自北京庄盟有限公司；倒置荧光显微镜购自日本Nikon；流式细胞仪均购自美国BD公司；酶标仪购自美国Bio-rad公司；CO2细胞培养箱购自美国西盟公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 从液氮罐中取出装有人结直肠癌细胞株HT-29、SW620和 HCT116的冻存管，立即放入37℃水浴锅中并轻轻摇动冻存管使其在1 min内溶解。在冻存管中加入含有10%FBS、100 μg/ml链霉素和100 U/ml青霉素的RPMI1640培养基，1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入细胞生长液悬浮细胞后，将细胞接种于96孔培养板中，37℃，5% CO2培养箱中培养24 h，更换新的培养基。细胞融合度达到90%以上时，加入胰酶消化细胞，完全培养基终止消化，1 000 r/min离心5 min，磷酸盐缓冲液(PBS)重悬细胞，离心，倒掉培养基，加入完全培养基培养，传代。

1.2.2 不同浓度亚硒酸钠对细胞增殖的影响 取生长至对数期的人结直肠癌细胞株HT-29、SW620和 HCT116，0.25%的胰酶消化，1 000 r/min离心5 min，调整细胞浓度为5×103个/ml，每孔加入100 μl细胞悬液，接种于96孔板中，37℃，5%CO2浓度培养箱中培养24 h。细胞贴壁后，弃去上清，加入终浓度为1.25、2.5、5、10、20 μmol/L的亚硒酸钠，不加亚硒酸钠为对照组，置于37℃，5%CO2浓度培养箱中培养48 h，每孔加入10 μl CCK8溶液，培养箱孵育3 h，用酶标仪在波长为490 nm处测定并记录各组的吸光度OD，计算细胞增殖抑制率及IC50，细胞抑制率=(1-实验组OD值/对照组OD值)×100%。

1.2.3 亚硒酸钠作用不同时间对细胞增殖的影响 取生长至对数期的人结直肠癌细胞株HT-29，细胞生长液悬浮细胞，调整细胞浓度为每毫升含有2×104个细胞，细胞接种于96孔板中，每孔加入100 μl细胞悬液，37℃，5%CO2浓度培养箱中培养24 h，加入终浓度为10、20 μmol/L的亚硒酸钠，不加亚硒酸钠的为对照组，置于37℃，5%CO2浓度培养箱中培养12、24、48、72 h后，每孔加入10 μl CCK8溶液，培养箱孵育3 h，酶标仪记录各组的吸光度OD，计算细胞增殖抑制率，细胞抑制率=(1-实验组OD值/对照组OD值)×100%。

1.2.4 亚硒酸钠对细胞凋亡的影响 采用Annexin V/PI双染法，用10、20 μmol/L的亚硒酸钠处理人结直肠癌细胞株HT-29 48 h后，胰蛋白酶消化细胞，PBS重悬细胞，调整细胞浓度每毫升含有2×106个细胞，取出1 ml细胞悬浮液，4℃ 1 000 r/min离心5 min，弃上清，PBS洗涤细胞3次，向细胞中加入200 μl缓冲液重悬细胞，分别加入10 μl PI和 Annexin-V，混合均匀后室温避光静置20 min，加400 μl缓冲液，流式细胞仪观察细胞凋亡情况。

1.2.5 Western印迹检测蛋白表达 取生长至对数期的人结直肠癌细胞株HT-29，培养基悬浮细胞后接种于培养瓶中，细胞贴壁及同步化处理后加入10、20 μmol/L的亚硒酸钠作用于细胞48 h，预冷的PBS洗涤细胞，适量的裂解液冰上裂解30 min，收集细胞，4℃ 13 000 r/min离心15 min，收集上清。按照试剂盒说明提取细胞蛋白并测定提取的蛋白浓度。将蛋白样品和上样缓冲液充分混匀，电泳分离，4℃转膜过夜。取膜，TBST洗膜3次，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，加入一抗、二抗孵育。TBST洗膜3次，显影，通过扫描系统分析蛋白表达量。

1.3 统计学处理 采用SPSS20.0软件进行方差分析。

2 结 果

2.1 不同浓度亚硒酸钠对细胞增殖的影响 1.25、2.5、5、10、20 μmol/L的亚硒酸钠作用于人结直肠癌细胞株HT-29、SW620和 HCT116 48 h后，CCK8检测结果显示，随着亚硒酸钠浓度的增加，人结直肠癌细胞株HT-29、SW620和HCT116的抑制率增大，具有浓度依赖性。亚硒酸钠对人结直肠癌细胞株HT-29、SW620和 HCT116的IC50分别为(5.060±1.01)、(6.701±1.21)、(7.471±1.47)μmol/L，后期选择人结直肠癌细胞株HT-29为研究对象。见表1。

2.2 亚硒酸钠作用不同时间对细胞增殖的影响 10、20 μmol/L的亚硒酸钠作用于人结直肠癌细胞株HT-29 12、24、48、72 h后CCK8检测结果显示，10和20 μmol/L的亚硒酸钠对细胞的抑制率在各个时间点都显著高于0 h抑制率(P<0.01)，且随着时间的延长抑制率增加。见表2。

2.3 亚硒酸钠对细胞凋亡的影响 10、20 μmol/L的亚硒酸钠作用于人结直肠癌细胞株HT-29 48 h后，细胞的凋亡率〔(1.28±0.26)%、(11.24±2.12)%〕均显著高于对照组〔(25.37±2.23)%〕，具有浓度依赖性(P<0.01)。

2.4 Western印迹检测蛋白的表达 10、20 μmol/L的亚硒酸钠作用于人结直肠癌细胞株HT-29 48 h后，细胞中Bax和p-AMPK的蛋白表达显著高于0 μmol/L组，Bcl-2和p-mTOR的蛋白表达显著低于0 μmol/L组(P<0.01)，且具有浓度依赖性。见图1，表3。

组别HT-29SW620HCT1160μmol/L1.8±0.661.74±0.611.83±0.621.25μmol/L13.21±2.561)10.32±1.981)9.02±1.561)2.5μmol/L27.32±2.371)22.32±2.211)19.26±3.021)5μmol/L48.62±2.741)41.57±2.631)38.43±3.211)10μmol/L67.36±2.681)61.36±3.111)58.89±1.981)20μmol/L85.87±2.571)80.58±2.231)77.62±1.871)

与0 μmol/L比较：1)P<0.01

组别10μmol/L20μmol/L0h1.81±0.361.84±0.3712h19.88±3.121)27.23±3.231)24h41.36±3.331)62.61±3.321)48h66.36±3.431)83.87±3.451)72h81.93±3.521)95.42±3.651)

与0 h比较：1)P<0.01

图1 亚硒酸钠对细胞中蛋白表达的影响

亚硒酸钠浓度(μmol/L)Bcl-2Baxp-AMPKp-mTOR00.289±0.0090.010±0.0070.247±0.0090.321±0.010100.157±0.0081)0.192±0.0081)0.371±0.0111)0.142±0.0081)200.090±0.0061)0.357±0.0101)0.489±0.0121)0.011±0.0071)

与0 μmol/L组比较：1)P<0.01

3 讨 论

肿瘤是机体在致癌因素作用下，局部组织细胞不能被正常调控而出现的异常增生或是分化而形成。恶性肿瘤的增殖及扩散非常快，可导致机体严重受损最终死亡，给人类的健康造成很大的威胁〔9,10〕。结直肠癌是消化道中高发的一种恶性肿瘤，随着人类饮食、环境等的改变，我国结直肠癌的发病率持续上升〔11〕。我国对结直肠癌的治疗一般采用手术治疗，放化疗辅助，对于晚期结直肠癌，一般采用全身化疗〔12〕。大多数化疗药物都存在一定的毒副作用，因此开发出有效、毒副作用小的化疗药物治疗结直肠癌非常重要。硒是人体必需的一种微量元素，其防癌和抗癌作用已受到广大研究者的关注。亚硒酸钠是一种无机硒，能诱导多种肿瘤细胞的凋亡〔13～15〕，但对于每一种肿瘤，亚硒酸钠诱导细胞凋亡的机制并不一样。研究显示，亚硒酸钠能抑制胃癌、肺癌等肿瘤细胞的增殖，促进细胞的凋亡且作用随着浓度的增加而增加〔13,14〕。本研究结果均说明，亚硒酸钠能抑制结直肠癌细胞的增殖，促进细胞凋亡。

细胞的凋亡是由多个因子和因素控制的，如caspase家族、Bcl-2家族、原癌基因和抑癌基因等〔16〕。Bcl-2是Bcl-2家族的抑凋亡基因，Bax是Bcl-2家族的促凋亡基因，两者之间可形成同源二聚体和异源二聚体〔17〕。有研究指出，细胞的凋亡取决于Bax和Bcl-2的比率，Bcl-2的表达下降而同时Bax的表达上升，则发挥促细胞凋亡的作用，反之则抑制细胞的凋亡〔18,19〕。本研究说明Bax和Bcl-2的比率促进了细胞的凋亡。

AMPK是一种异源三聚体蛋白，由α催化亚基和β、γ调节亚基组成，它能调控细胞的能量代谢并通过p53和mTOR调控细胞的凋亡〔20〕。研究证实，在多种肿瘤细胞中，AMPK都能被异常激活，AMPK磷酸化的激活可对mTOR、P13K等一些在细胞能量代谢过程中的关键蛋白激酶进行调控，从而影响细胞凋亡〔21〕。本研究说明亚硒酸钠可能通过激活AMPK信号通路，进而抑制mTOR信号通路，从而促进细胞凋亡。

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〔2016-11-02修回〕

(编辑 郭 菁)

更正 曹正涛所撰写论文《老年中低位直肠癌患者手助腹腔镜与开腹直肠癌根治术的疗效比较》已在我刊2016年36卷第20期第5043～5045页发表，作者曹正涛单位应为：天津医科大学研究生院。

广西自然科学基金面上项目(2013GXNSFAA019353)

张剑波(1965-)，男，硕士，副主任医师，主要从事消化道肿瘤研究。

廖漓漓(1971-)，女，主治医师，主要从事肿瘤临床研究。

R735.3+7

A

1005-9202(2017)06-1313-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.06.005

1 桂林医学院病理生理教研室 2 桂林医学院附属医院消化内科