缺氧诱导因子-1α和Survivin蛋白在非小细胞肺癌中的表达及其与人乳头状瘤病毒感染的相关性

周 颖 赵 敏 张 辉 谢永红 李晓超 尹端端

(秦皇岛市第一医院病理科，河北 秦皇岛 066000)

缺氧诱导因子-1α和Survivin蛋白在非小细胞肺癌中的表达及其与人乳头状瘤病毒感染的相关性

周 颖 赵 敏 张 辉 谢永红1李晓超 尹端端2

(秦皇岛市第一医院病理科，河北 秦皇岛 066000)

目的 研究非小细胞肺癌(NSCLC)中缺氧诱导因子(HIF)-1α和Survivin蛋白的相关性并分析HIF-1α和Survivin与人乳头状瘤病毒(HPV)感染的相关性。方法 应用免疫组化法检测60例NSCLC及20例肺良性病变组织中HIF-1α、Survivin蛋白的表达，应用PCR方法选用HPV16、18型特异性引物检测两组中HPV DNA的表达。 结果 ①NSCLC中HIF-1α和Survivin的表达阳性率分别为48.3%和38.3%，肺良性病变组均未见阳性表达，差异均有统计学意义(P<0.05)。②NSCLC中HIF-1α的表达率与Survivin呈正相关(r=0.335,P<0.05)。③HPV DNA检出率NSCLC组为41.7%，肺良性病变组5.0%，二者有显著差异(P<0.05)。④HPV DNA阳性组与阴性组间HIF-1α的阳性表达率分别为52.0%和45.7%，无统计学差异(P>0.05)。HPV DNA阳性组与阴性组间Survivin的阳性表达率分别为36.0%和40.0%，差异无统计学意义(P>0.05)。结论 HIF-1α与Survivin在NSCLC的发生发展中具有重要作用；HPV感染可能是NSCLC发生的病因学因素之一；然而NSCLC中HIF-1α、Survivin表达与HPV感染均无协同作用。

非小细胞肺癌；缺氧诱导因子-1α；Survivin蛋白；人乳头状瘤病毒

缺氧诱导因子(HIF)-1α在肺癌、乳腺癌等多种肿瘤组织中过度表达。HIF-1α可使Survivin蛋白表达增高，推测HIF-1α可能在介导Survivin的转录活化中发挥重要作用。人乳头状瘤病毒(HPV)是一种DNA病毒，感染人和动物的皮肤或黏膜可引起增殖性损伤。近年来，研究检测出肺癌患者携带HPV〔1，2〕，尤其是HPV 16、18型。但HPV感染与肺癌的关系，目前说法不一。然而在肺癌中HIF-1α、Survivin与HPV感染的关系尚未见报道。本文研究非小细胞肺癌(NSCLC)中HIF-1α和Survivin的相关性，探讨HIF-1α和Survivin在NSCLC发生发展中的作用，并分析他们与HPV感染的相关性。

1 材料与方法

1.1 标本 收集秦皇岛市第一医院2012年1～5月NSCLC新鲜标本60例，男46例，女14例；年龄36～80岁；鳞癌42例，腺癌18例；高分化12例，中分化29例，低分化19例；淋巴结转移30例，吸烟者43例。20例肺良性病变组织，包括肺结核6例，炎性假瘤5例，硬化性血管瘤4例，肺大疱4例，支气管扩张1例。标本取材后，部分置-20℃保存，部分40%甲醛固定，石蜡包埋。

1.2 HPV PCR检测

1.2.1 引物 选用分别用来扩增HPV16、18型的特异性引物2对。引物均由北京奥科生物公司合成。HPV16E6正义链5′-CTG CAA GCA ACA GTT ACT GCG ACG-3′;反义链5′-CAT ACA TCG ACC GGT CCA CC-3′；长度315 bp；HPV18E7正义链5′-GAG CCG AAC CAC AAC GTC AC-3′；反义链5′-GGA TGC ACA CCA CGG ACA CA-3′；长度152 bp。

1.2.2 组织DNA的提取 取适量冻存组织，加提取缓冲液制成单细胞悬液后，沸水浴10 min，冷却至室温加蛋白酶K消化，酚-氯仿-异戊醇反复抽提3次，再经100%冰冷无水乙醇沉淀、70%冰冷无水乙醇洗涤后，加TE〔10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，pH8.0〕缓冲液溶解所得DNA并4℃保存。

1.2.3 聚合酶链反应(PCR)扩增 PCR反应体系：每25 μl反应体系中包含 10×倍缓冲液 2.5 μl，20 pmol/μl引物各0.5 μl，Taq酶1 μl(1 U/μl)，Mg2+1.5 μl，dNTPs 0.5 μl，去离子水16.5 μl及DNA模板2 μl。扩增条件：94℃预变性5 min，循环特征为94℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 45 s，共30个循环，72℃延伸8 min。每次实验以不加模板为阴性对照，HPV16、18型分别用Siha和Hela细胞株DNA作阳性对照。PCR扩增产物用加有溴乙啶的1.5%琼脂糖凝胶，80 V电压下电泳约40 min，于紫外透射仪上观察结果。

1.3 HIF-1α、Survivin免疫组化检测 HIF-1α抗体、Survivin抗体及通用型SP试剂盒均购自福州迈新生物技术开发公司，染色步骤严格按试剂盒说明书操作。一抗稀释浓度为1∶100。阴性对照用PBS代替一抗。

HIF-1α阳性表达为细胞核出现棕黄或棕褐色颗粒，Survivin阳性表达为胞质出现棕黄或棕褐色颗粒，显色结果由两位病理医生采用半定量评分系统独立判定。每例均高倍镜下(×400)随机选择5个视野，每个视野计数200个细胞，取平均值，用半定量积分法判断结果：0分阴性；1分<25%；2分25%～75%；3分>75%。阳性强度：1分弱表达(浅黄色)；2分中等强度表达(棕黄色)；3分强表达(棕褐色)。两者积分相乘，0～1分为阴性(-)，2～3分为弱阳性(±)，4～6分为中等阳性(+)，7～9分为强阳性()。就其结果进行分析，将-、±合并为“-”，+、合并为“+”，以简化数据处理。

1.4 统计学方法 应用SPSS12.0软件进行统计学分析，组间比较采用χ2检验。

2 结 果

2.1 HIF-1α、Survivin的检测结果及两者的相关性 NSCLC中HIF-1α的阳性表达位于细胞核(图1)，阳性率为48.3%(29/60)，肺良性病变组未见阳性表达，二者差异有统计学意义(χ2=15.163,P<0.05)。Survivin的阳性表达位于胞质(图1)，阳性率为38.3%(23/60)，肺良性病变组未见阳性表达，二者差异有统计学意义(χ2=10.760,P<0.05)。HIF-1α阳性组中Survivin的表达率55.2%(16/29)，明显高于HIF-1α阴性组〔22.6%(7/31)，χ2=6.733，P<0.05〕，经统计学分析，两者呈正相关(r=0.335,P<0.05)。

2.2 NSCLC中HIF-1α、Survivin表达与临床病理特征的关系 NSCLC组中HIF-1α表达与性别、年龄、吸烟、组织学分型无关，与组织分化程度及淋巴结转移相关。NSCLC组中Survivin表达与性别、年龄、吸烟、组织学分型、组织分化程度无关，与淋巴结转移相关(P<0.05)。见表1。

2.3 HPV DNA的PCR检测结果及与临床病理特征的关系 HPV DNA检出率NSCLC组为41.7%(25/60)，肺良性病变组5.0%(1/20)，二者有显著差异(χ2=9.193,P<0.05,图2)；HPV16、18型特异性引物分型检测，HPV16型12例，检出率为48.0%(12/25)，18型13例，检出率为52.0%(13/25)。NSCLC组HPV感染与性别、年龄、吸烟、组织学分型无关，而与组织分化程度及淋巴结转移相关(P<0.05)。见表1。

2.4 NSCLC中HIF-1α、Survivin的表达与HPV感染的关系 HPV DNA阳性组与阴性组间HIF-1α的阳性表达率分别为52.0%(13/25)和45.7%(16/35)，二者差异无统计学意义(χ2=0.231，P=0.631)。HPV DNA阳性组与阴性组间Survivin的阳性表达率分别为36.0%(9/25)和40.0%(14/35)，二者差异无统计学意义(χ2=0.099，P=0.753)。

表1 NSCLC中HIF-1α、Survivin阳性表达及HPV感染阳性表达与临床病理特征的关系〔n(%)〕

图1 NSCLC中HIF-1α及Survivin阳性表达(DAB，×400)

M：Marker；1、2：HPV16 阳性、阴性对照；3、4：HPV16；5、6：HPV18 阳性、阴性对照；7、8：HPV18图2 PCR检测HPV16、18型DNA扩增结果电泳图

3 讨 论

HIF-1是由α、β亚单位构成的异二聚体，其中HIF-1α受缺氧的调节。缺氧是实体肿瘤微环境特征之一。在细胞缺氧时，细胞核中HIF-1α显著增加。HIF-1α不仅调节众多的下游基因以维持或促进肿瘤的血管形成和肿瘤的发展，而且可反馈接受肿瘤生长过程中产生的因子或缺氧环境上调表达，如此形成恶性循环促进肿瘤生长、浸润和转移〔3〕。本研究提示HIF-1α在NSCLC的发生发展中起重要作用，与组织分化程度、淋巴结转移有关，与Swinson等〔4〕的结果基本一致。高分化型HIF-1α的表达率低于中、低分化型，推测肿瘤分化程度降低，缺氧程度明显加重，HIF-1α表达上调，通过与缺氧反应元件作用便利于肿瘤克服缺氧并诱导新生血管形成，浸润生长。淋巴结转移组HIF-1α的表达率高于无淋巴结转移组。有研究报道HIF-1α通过调节其下游基因VEGF诱导肿瘤新生淋巴管形成；同时上调COX-2，促使癌细胞对基质的黏附性增加，E-cadherin蛋白水平下降，使癌细胞易于转移，提示HIF-1α是NSCLC发生发展中的关键步骤，并参与肿瘤的侵袭和转移〔5〕。

Survivin是凋亡抑制蛋白家族的新成员，是迄今发现最强的凋亡抑制因子，在人类多种肿瘤组织中异常表达〔6,7〕。Survivin具有抑制细胞凋亡、调节细胞周期和细胞分裂的双重功能，表达于细胞周期的G2/M期，定位于细胞有丝分裂的纺锤体上，通过直接或间接抑制Caspase活性而发挥抗凋亡作用。本研究提示Survivin是NSCLC发生发展进程中的重要因子。陈余清等〔8〕对Survivin启动子5'上游非编码序列生物信息学分析发现，Survivin核心启动子位于TSS上游-203～+64 bp处，其中-19～16 bp和-133～136 bp两处存在潜在的HIF-1α结合位点。Peng等〔9〕在乳腺癌的研究中发现，在乏氧或常氧条件下，表皮生长因子(EGF)诱导表达的HIF-1α蛋白可通过结合Survivin核心启动子片段(-203～+27 bp)中的潜在HIF-1α位点，上调Survivin表达。另外，有研究发现在胰腺癌，结直肠癌中过表达的HIF-1α上调Survivin表达〔10〕。体外研究采用HIF-1α基因沉默导致Survivin的表达下调，表明两者存在显著正相关〔11〕。陈中建〔12〕和张晓燕等〔13〕研究发现HIF-1α对Notch和胰岛素样生长因子受体诱导的Survivin的表达有协调作用，表明HIF-1α在Survivin的表达调控中起着非常重要的作用。本研究提示Survivin可能是HIF-1α的靶基因之一，HIF-1α通过上调Survivin的表达抑制肿瘤细胞凋亡，两者在NSCLC发生发展中起协同作用。本研究显示，Survivin的表达与淋巴结转移有关，说明Survivin的表达预示肿瘤有较高的侵袭性和不良预后。

HPV感染是宫颈癌的主要病因，然而近年来HPV感染与肺癌的关系已经引起人们的重视〔14〕。本研究提示HPV感染可能是NSCLC发生的病因学因素之一。HPV感染与NSCLC患者临床病理资料的关系目前尚未明确，本研究发现HPV感染与性别、年龄、吸烟、组织学分型无关，与组织分化程度、淋巴结转移相关。高分化型NSCLC HPV DNA的检出率低于中、低分化型，可能是由于分化成熟的细胞退出了细胞周期，细胞不再具有分裂能力，细胞内仅有少量病毒复制所需的复制酶。淋巴结转移组HPV DNA的检出率高于无淋巴结转移组。Lane等〔15〕报道HPV(+)的肿瘤细胞株与HPV(-)的相比血管内皮生长因子(VEGF)的表达水平普遍升高。Lopez-ocejo等〔16〕认为HPV E6可能如一些原癌基因一样能够使VEGF表达增强。VEGF不仅诱导血管生成，还可诱导肿瘤外周形成新的淋巴管，促进癌细胞通过淋巴管转移到淋巴结。由此推测HPV感染与淋巴结转移可能存在一定的相关性。

HIF-1α与HPV感染之间的关系国内外研究较少，其可能的联系有：野生型P53蛋白可通过直接抑制HIF-1α转录活性和通过促进mdm2介导的HIF-1α泛素化-蛋白酶降解两种形式抑制HIF-1α活性。而Munger〔17〕报道HPV16、18型E6可以降解野生型P53蛋白。本课题组先前研究也发现，HPV DNA阳性组P53基因的突变失活率明显高于HPV DNA阴性组。推测HPV16、18型E6可能通过降解野生型P53蛋白，诱导P53基因突变，从而促进HIF-1α的积聚〔18〕，但本研究未发现两者有相关性。Muzio等〔19〕发现在HPV阳性的鳞状细胞癌中Survivin亦呈高表达，然而本研究未发现NSCLC中Survivin表达与HPV感染有关联。

综上所述，HIF-1α与Survivin在NSCLC的发生发展中具有重要协同作用，检测NSCLC组织中HIF-1α、Survivin的表达，可以为临床判断肿瘤的恶性程度及预后提供有效参考，同时为靶向HIF-1α的抗肿瘤治疗提供理论依据和实验基础。

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〔2015-08-19修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

秦皇岛市科技支撑计划项目(2012023A135)

赵 敏(1973-)，女，主任医师，博士，主要从事肿瘤病理研究。

周 颖(1981-)，女，主治医师，硕士，主要从事肿瘤病理研究。

R734.2

A

1005-9202(2017)06-1406-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.06.044

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