在线净化液相色谱-高分辨质谱法快速测定动物源性食品中均三嗪类药物及其代谢产物的残留量

张海超，马育松，李 颖，艾连峰*，徐牛生，陈瑞春，郭春海

(1.河北出入境检验检疫局，河北 石家庄 050051；2.赛默飞世尔科技(中国)有限公司，上海 201206)

在线净化液相色谱-高分辨质谱法快速测定动物源性食品中均三嗪类药物及其代谢产物的残留量

张海超1，马育松1，李 颖1，艾连峰1*，徐牛生2，陈瑞春1，郭春海1

(1.河北出入境检验检疫局，河北 石家庄 050051；2.赛默飞世尔科技(中国)有限公司，上海 201206)

基于在线净化液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱技术建立了快速测定动物源食品中地克珠利、妥曲珠利、妥曲珠利砜和妥曲珠利亚砜残留的分析方法。样品采用乙腈提取，经Cyclone在线净化柱净化后，将富集的目标物洗脱转至C18分析柱，经色谱分离后，采用四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱以Full Scan/ddMS2模式进行检测。4种化合物在0.5～50 ng/mL范围内呈良好线性，相关系数均大于0.999 4，方法的定量下限(LOQ)为 2 μg/kg。待测物在4种基质中的加标回收率为80.2%～110.5%，相对标准偏差为2.8%～9.7%。该方法简化了前处理过程，消除了基质干扰。利用精确质量数、保留时间、同位素峰比、二级碎片多个定性信息能够实现快速确证测定。

在线净化；静电场轨道阱高分辨质谱；地克珠利；妥曲珠利；妥曲珠利亚砜；妥曲珠利砜；动物源食品

近年来广谱、高效、低毒性的均三嗪类抗球虫药在畜牧业生产中得到了广泛使用[1-2]。目前使用的均三嗪类药物主要有地克珠利和妥曲珠利，二者均可有效杀灭包括球虫在内的多种原虫，属高效抗球虫药物。地克珠利作用时间短，需要长期用药才能达到防治目的，导致该药极易在组织中蓄积。妥曲珠利在动物体内代谢为妥曲珠利砜和妥曲珠利亚砜，毒理学试验表明妥曲珠利可能有致畸毒性，对人体的健康产生威胁。因此我国对这两种均三嗪类药物制定了严格的限量标准[3]，但是这4类化合物在日常监测中超标现象依然时有发生，不断威胁着消费者的健康。

目前地克珠利和妥曲珠利的检测方法中应用较多的是液相色谱法[4-6]和液质联用法[7-11]等。液相色谱法测定这4种化合物在色谱分离上难度很大，而且无法很好地解决杂质干扰的问题；采用液质联用法测定虽可以有效避免色谱分离的问题，但该类化合物的特征碎片离子较少，妥曲珠利和妥曲珠利砜甚至无特征碎片离子而不得不采用母离子定性定量，因此极易受到基质干扰，导致结果判断不准确。而具有高灵敏度、高选择性的高分辨质谱技术在很大程度上弥补了此缺陷。木合他拜尔等[12]利用静电场轨道阱高分辨质谱技术(Q-Exactive)测定了鸡肉中6种抗球虫药物，地克珠利和妥曲珠利的定量下限可达5 μg/kg，取得了较好的实验效果，但该方法采用的QuEChERS净化手段面对动物源基质依然存在着净化不够完全的现象。TurboFlow在线净化技术与传统净化方式相比，具有溶剂消耗少，样品分析效率高，在线净化柱可重复使用等优点，在残留分析领域得到了广泛应用[13-17]。本文采用TurboFlow在线净化液相色谱与四极杆轨道阱高分辨质谱仪联用技术分析了动物源食品中地克珠利和妥曲珠利及其代谢产物的残留量，方法简单、快速、准确。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

TurboFlow在线净化液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱仪Q-Exactive(美国ThermoFisher公司)，由CTC多功能自动进样器(配有200 μL定量环)、两个耐压1 250 bar的四元梯度液相泵、六通阀切换装置和Q-Exactive四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱仪组成。液相色谱-三重四极杆串联质谱仪8050(日本岛津公司)，Sigma 3K-15型离心机(美国Sigma公司)，PT2100型均质器(瑞士Kinematica公司)，涡旋混合器(美国Scientific Industries)，Milli-Q纯化系统(美国Millipore公司)。

地克珠利、妥曲珠利、妥曲珠利亚砜和妥曲珠利砜标准品均购于德国Dr.Ehrenstorfer公司，纯度大于98%；乙腈、甲醇、丙酮、异丙醇、甲酸为色谱纯，氯化钠为分析纯，实验用水为Milli-Q高纯水。

1.2 实验部分

1.2.1 样品制备 准确称取粉碎均匀样品5.0 g(精确至0.01 g)于50 mL塑料离心管中，加入2 g氯化钠和20 mL乙腈，于均质器上均质1 min，以5 000 r/min离心5 min。取1 mL左右的上清液经0.22 μm微孔滤膜过滤后进样测定。

1.2.2 在线净化色谱条件 在线净化程序由净化(TFC)和分离(HPLC)两部分组成。净化柱为Cyclone聚合物柱(0.5 mm×50 mm，60 μm 粒径，60 Å孔径)；上样泵的流动相A为纯水溶液、B为乙腈、C为丙酮+乙腈+异丙醇(1∶1∶1)，进样量为50 μL；HPLC的分析柱为资生堂CAPCELLPAK(150 mm×2.1 mm，2.7 μm)；流动相:A为0.1%的甲酸水溶液，B为乙腈，其在线净化梯度洗脱程序见表1。TFC在程序中每步的变化采用瞬变模式，HPLC每步的变化除最后一步采用瞬变模式外其他步骤间改变采用渐变模式。整个运行时间为10 min。

表1 在线净化梯度洗脱程Table 1 Gradient elution procedure of TurboFlow on-line cleanup

(续表1)

StepNo.(步骤)Starttime/min(起始时间)Stoptime/min(持续时间)Loadingpump(上样泵)Elutionpump(洗脱泵)Function(目的)Flow/(流速,mL·min-1)A(%)B(%)C(%)Function(目的)Flow/(流速,mL·min-1)A(%)B(%)44.003.0Cleaning(淋洗)2.00100Elution(洗脱)0.4455557.001.5Loopfilling(充满定量环)2.003070Elution(洗脱)0.4109068.501.5Conditioning(条件化)2.00100Conditioning(条件化)0.48020

1.2.3 质谱条件 电喷雾离子源(ESI)温度：300 ℃；毛细管电压:3 200 V；负离子扫描模式；扫描范围:m/z350～550；化合物提取精确质量数及二级特征碎片离子见表2；一级质谱全扫描分辨率:R=70 000；C-trap最大容量(AGC target):5×105；C-trap最大注入时间:100 ms；数据依赖二级子离子全扫描(ddMS2)分辨率:R=17 500；归一化碰撞能量：35 eV±50%；C-trap最大容量(AGC target):5×104；C-trap最大注入时间:50 ms；动态排除:5 s。

表2 4种抗球虫药的名称、分子式及部分质谱参数Table 2 Names，formulaes and some MS parameters of four anticoccidials

* there is no fragment ion

2 结果与讨论

2.1 提取溶剂的选择

图1 地克珠利(a)、妥曲珠利(b)、妥曲珠利砜(c)及妥曲珠利亚砜(d)优化后的在线净化条件色谱图(不接分析柱)Fig.1 Chromatograms of diclazuril(a)，toltrazuril(b)，toltrazurilsulfone(c)and toltrazurilsulfoxide(d)under optimized online cleanup conditions(no connected to the analytical column)

考察了乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯和丙酮4种提取剂的提取效率。结果显示，乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯为提取剂时回收率均较高，而采用丙酮为提取剂时回收率较低。考虑到二氯甲烷比重大，提取离心后上清液中仍有样品残渣悬浮，转移较为费力且毒性较大；乙酸乙酯在提取目标物的同时会提取出较多的脂肪和蛋白质，给后续净化带来一定困难。而乙腈则能更有效地沉淀蛋白，减少杂质干扰，同时无需转换定容液可直接进仪器分析，因此实验选择乙腈作为最佳提取溶剂。

2.2 在线净化条件的优化

TurboFlow在线净化条件分为3个部分：上样、转移、淋洗。实验采用不接分析柱，分流进质谱以反相洗脱模式优化每一步实验过程。首先选定纯水溶液作为上样溶液，乙腈作为洗脱溶剂，比较了C18，Cyclone和Cyclone-P作为在线净化柱对目标化合物的保留及洗脱情况，发现Cyclone对4种化合物均能有效保留且易于洗脱。在此条件下，对不同比例的净化流动相A相和B相作洗脱溶剂进行了考察，结果发现当洗脱剂中B相的比例大于70%时，分析物均能被完全洗脱。其优化后的在线净化过程所得的色谱图如图1所示，0～1 min为上样过程，1～2 min为洗脱转移部分，2 min以后开始进行淋洗和条件化。淋洗过程采用强淋洗溶剂淋洗掉TFC柱上的强保留杂质，然后用洗脱溶剂充满洗脱环并以TFC流动相A初始化TFC柱，以备下一个样品的分析。本实验选用丙酮+乙腈+异丙醇(1∶1∶1)作为强淋洗溶剂，建立了表1的梯度条件。

2.3 分离条件的建立

分析柱是将由TFC柱洗脱下的分析物进行分离。TFC的洗脱液与HPLC流动相的初始比例对分析物及分离影响很大。本实验分别选择纯水、0.1%甲酸溶液、0.5 mmol/L乙酸铵-0.02%乙酸水溶液作为水相(A)，甲醇和乙腈分别作为有机相(B)，进行流动相的选择实验。结果发现，以0.1%甲酸溶液为水相，乙腈为有机相，采用时间梯度洗脱条件时，4种化合物的峰形较好。

2.4 质谱条件的选择及定性确证方法的建立

实验采用正负同时扫描的模式对4种化合物进行检测，发现4种化合物只在ESI-模式下有响应，且均出现[M-H]-峰。故采用负模式下全扫描和数据依赖扫描模式(Full Scan/ddMS2)进行化合物的测定。通过全扫描的数据可获得精确质量数、保留时间和同位素峰分布信息。采用35eV±50%的碰撞能量可得到二级质谱信息，选用丰度较高的碎片离子作为特征离子。将上述色谱和质谱信息在Q-Exactive自带的Exactfinder软件上建立了定性确证方法。该方法可通过保留时间、精确质量数、同位素分布、二级碎片等多个信息来实现4种分析物尤其是妥曲珠利和妥曲珠利砜这类无特征子离子化合物的准确定性分析。与低分辨的三重四极杆质谱相比，高分辨质谱方法可得到更多的特征质谱信息，定性结果更为准确。在不同基质样品的应用表明，该方法的特异性强，无干扰组分出现，可作为确证方法。

2.5 基质影响的消除与方法的线性

Q-Exactive因其高分辨率可有效避免基质对定性定量的干扰，尤其对于无特征碎片以母离子→母离子定性定量的化合物优越性更为明显。本文采用LC-MS/MS的MRM模式及Q-Exactive的Full Scan/ddMS2分别进行测定，对比后发现，相比于低分辨的三重四极杆，Q-Exactive利用精确的质量数定性定量后显著提高了化合物的选择性，避免了基质造成的干扰，保证了分析测试的灵敏度。如图2所示，在线净化高分辨质谱得到的鸡肉样品基质中妥曲珠利(2 ng/mL)的一级提取离子色谱图(b1)基线明显优于由三重四极杆质谱得到的多反应监测质谱图的基线(a1)；从纯标准溶液的质谱图对比，在线净化高分辨质谱图的信噪比(b2)也好于三重四极杆质谱图(a2)，且在线净化高分辨质谱得到的样品基质质谱图与标准溶液的质谱图基本相当，说明基质影响较弱，净化效果满足测试要求。

图2 妥曲珠利的多反应监测色谱图(MRM)和在线净化高分辨提取离子色谱图Fig.2 MRM chromatograms and online clean up HRMS chromatograms of toltrazuril a1：MRM chromatogram of chicken matrix solution；a2：MRM chromatogram of standard solution；b1：online cleanup HRMS chromatogram of chicken matrix solution；b2：online cleanup HRMS chromatogram of standard solution

根据分析物的灵敏度，选用鸡肉、牛肉、鸡蛋和牛奶的空白基质溶液配制基质匹配标准溶液及乙腈配制纯溶剂标准溶液并制作校准曲线，进行斜率比较。结果显示，不同基质的斜率比均在0.8～1.2之间，说明基质效应不明显，可以选用乙腈配制标准工作液对化合物进行校正。用乙腈配制成质量浓度分别为0.5，2，5，10，20，50 ng/mL的系列标准工作溶液，依次进样测定。结果显示，4种待测物在0.5～50 ng/mL范围内线性良好，相关系数为0.999 4～0.999 5。

2.6 方法的回收率、精密度与定量下限

选取鸡肉、牛肉、鸡蛋和牛奶空白基质样品，分别在2，5，20 μg/kg 3个浓度水平下做加标回收实验，每个水平平行6次，其回收率及相对标准偏差见表3。由表3可知，方法的回收率在80.2%～110.5%之间，相对标准偏差为2.8%～9.7%。以能准确测得空白基质最小添加量的方式，确定方法的定量下限(LOQ)为2 μg/kg。

表3 方法的加标回收率及相对标准偏差(n=6)Table 3 Recoveries and RSDs of the method(n=6)

图3 地克珠利阳性样品的确证图Fig.3 Confirms of diclazuril in a positive sample A:mass spectrum and isotope ratio of diclazuril[M-H]-m/z 404.971 83 with a mass tolerance of 5 ppm by full scan mode，# theoretical value of isotope peak，*measured values of isotope peak，1:405.975 39,2:406.969 29,3:407.972 17,4:408.966 25，5:409.969 35，6:410.237 56;fragment mass spectrum of [M-H]-m/z 404.97 with 35% NCE by ddMS2 mode of standard solution(B1) and sample(B2)

2.7 实际样品的测定

采用本方法对12份送检的样品进行检测，样品经过前处理、仪器测定后将数据导入定性确证方法软件进行分析。其中1份鸡肉样品的地克珠利在筛查中显示为阳性，该化合物在5 ppm质量数偏差范围内获得的离子色谱图的保留时间与定性确证方法中该化合物保留时间一致，而后对其进一步进行同位素峰形匹配和精确碎片离子分析。图3A为该化合物所获得的母离子精确质量数(404.971 83)及其同位素峰(405.975 39，406.969 29，407.972 17，408.966 25和409.969 35)，将其与地克珠利理论同位素峰的分布进行比较，完全匹配。而图3B则为该化合物在质量数为404.97下所触发的ddMS2扫描，在35%的高能量碰撞下获得该化合物的二级质谱图，从图中可看出具有该化合物的特征二级质谱碎片离子(333.97和404.97)，且离子比符合相关规定要求，因此定性判断为阳性。对于该样品采用地克珠利标准溶液重新定量校正，定量结果为22 μg/kg。

3 结 论

本文采用TurboFlow在线净化技术与高分辨率质谱联用手段建立了动物源性食品中地克珠利、妥曲珠利、妥曲珠利亚砜和妥曲珠利砜的残留检测方法。方法采用在线净化技术简化了前处理过程，提取后即可进样，操作简单、快速。四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱可通过精确母离子分子量、保留时间、同位素分布以及二级特征碎片等信息定性分析，实现对化合物的有效确证。该方法大大提高了检测效率，且选择性和抗干扰能力强，避免了假阳性结果的出现，可用于动物源性食品中地克珠利、妥曲珠利及其代谢产物的快速检测。

[1] Shi Z H,Ge Q L,Lu J X，Liu X X，Gong J S，Zhu L Q，Qi K Z，Chen D D，Peng K S.Chin.J.Chromatogr.(施祖灏，葛庆联，陆俊贤，刘学贤，龚建森，朱良强，祁克宗，陈玎玎，彭开松．色谱)，2009，27(3)：303-307.

[2] Wu Y N,Shao B,Shen J Z.DetectionandMonitoringTechnologyofVeterinaryDrugResidues.Beijing：Chemical Industry Press(吴永宁，邵兵，沈建忠．兽药残留检测与监控技术.北京：化学工业出版社)，2007：586-587.

[3] http://jckspaqj.aqsiq.gov.cn/dwyxspjyjy/gnxgbz/200610/t20061027_9809.htm(中华人民共和国农业部公告第235号)，[2002-12-14].

[4] Lin X J,Lu C B,Bao A Q,Zhou Z J,Luo C J,Li X J,Ying Y F.Chin.J.Vet.Drug(林仙军，陆春波，包爱情，周芷锦，罗成江，李孝军，应永飞．中国兽药杂志)，2015，49(3)：53-57.

[5] Liu Y T,Ai X H,Li L,Zhao F,Yang Q H,Xu N.Chin.J.Anal.Lab.(刘永涛，艾晓辉，李乐，赵凤，杨秋红，胥宁．分析试验室)，2014，33(4)：420-423.

[6] Qi K Z,Shi Z H,Peng K S,Tu J,Zhu L Q,Chen D D.Chin.J.Anal.Chem.(祁克宗，施祖灏，彭开松，涂健，朱良强，陈玎玎．分析化学)，2007，35(11)：1601-1606.

[7] Gong X M,Sun J，Dong J，Yu J L，Wang H T.Chin.J.Chromatogr.(宫小明，孙军，董静，于金玲，王洪涛．色谱)，2011，29(3)：217-222.

[8] Yue Z F,Kang H N,Chen X X,Xiao C G,Hou L X,Luo Z J，Zhao F J,Shen J C.Chin.J.Anal.Chem.(岳振峰，康海宁，陈小霞，肖陈贵，侯乐锡，罗志军，赵凤娟，沈金灿．分析化学)，2012，40(8)：1262-1266.

[9] Shi Z H,Zhang X Y,Bu S J,Chen D W,Pu J H,Gao Y S，Tang X J.Chin.J.Chromatogr.(施祖灏，张小燕，卜士金，陈大伟，蒲俊华，高玉时，唐修君．色谱)，2012，30(9)：883-888.

[10] Zhang T,Zhang L F,Jiang S X,Xue F Q.J.AnhuiAgric.Sci.(张涛，张丽芳，江善祥，薛飞群．安徽农业科学)，2009，37(14)：6314-6316.

[11] Ai L F，Sun H W，Wang F C，Chen R C，Guo C H.J.Chromatogr.B，2011，879(20)：1757-1763.

[12] Muhe T B E,Yan H,Xu S,Feng N,Hao J,Zhu C Q,Guo S,Zhang C H,Han N Y.Chin.J.Chromatogr.(木合他拜尔，严华，徐姗，冯楠，郝杰，朱尘琪，郭爽，张朝晖，韩南银．色谱)，2015，33(11)：1199-1204.

[13] Ai L F，Ma Y S，Chen R C，Guo C H，Kang Z S.Chin.J.Anal.Chem.(艾连峰，马育松，陈瑞春，郭春海，康占省．分析化学)，2013，41(8)：1194-1198.

[14] Mottier P,Hammel Y A,Gremaud E,Guy P A.J.Agric.FoodChem.，2008，56(1)：35-43.

[15] Roach J A G,Dibussolo J M,Krynitsky A,Noonan G O.J.Chromatogr.A，2011，1218(1)：4284-4290.

[16] Zhang H C,Ai L F,Guo C H,Zhang J W,Ge S H,Dou C Y,Liu H L.J.Instrum.Anal.(张海超，艾连峰，郭春海，张婧雯，葛世辉，窦彩云，刘慧玲．分析测试学报)，2014，33(3)：295-300.

[17] Duan Y S,Wang B L,Ai L F,Guo C H,Ge S H,Zhang J W,Xu N S.Chin.J.Chromatogr.(段永生，王炳玲，艾连峰，郭春海，葛世辉，张婧雯，徐牛生．色谱)，2014,32(6)：647-652.

Rapid Determination of Diclazuril,Toltrazuril and Their Metabolite Residues in Foods of Animal Origin by On-line Cleanup Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry

ZHANG Hai-chao1，MA Yu-song1,LI Ying1，AI Lian-feng1*，XU Niu-sheng2，CHEN Rui-chun1，GUO Chun-hai1

(1.Hebei Entry and Exit Inspection and Quarantine Bureau,Shijiazhuang 050051,China；2.Thermo Fisher Scientific (China),Shanghai 201206,China)

A new method was developed for the rapid determination of diclazuril，toltrazuril，toltrazurilsulfone and toltrazurilsulfoxide residues in foods of animal origin by on-line cleanup liquid chromatography-high resolution benchtop quadropole/obitrap mass spectrometry(HRMS) .The samples were extracted with acetonitrile，and purified on a Cyclone column.The analytes were eluted from the exaction column and put into a C18analytical column prior to chromatographic separation and detection in full scan/ddMS2mode.The calibration curves were linear in the range of 0.5-50 ng/mL with correlation coefficients more than 0.999 4.The limits of quantitation(LOQ) were 2 μg/kg.Average recoveries of the analytes in four matrices ranged from 80.2% to 110.5%，with relative standard deviations of 2.8%-9.7%.With simple pretreatment，low matrix effects,this method could be used for the rapid confirmation with accurate mass of quasi-molecular ion，retention time，isotope ratio and qualitative fragments.

on-line cleanup;obitrap high-resolution mass spectrometry;diclazuril;toltrazuril;toltrazurilsulfone;toltrazuril sulfoxide；foods of animal origin

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.03.006

2016-08-25；

2016-11-20

国家质检总局科技计划项目(2013IK154)

O657.63;TQ460.72

A

1004-4957(2017)03-0331-06

*通讯作者：艾连峰，博士，高级工程师，研究方向：食品安全分析，Tel：0311-85980742，E-mail：ai_lianfeng@126.com